一种稻瘟病抗性相关的miRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种稻瘟病抗性相关的miRNA，具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。该miRNA的表达量与调控水稻抗稻瘟病基因Pik2‑H4的表达量呈负相关，能够通过抑制该miRNA的表达构建抗稻瘟病的水稻高抗新品种。

A rice blast resistance related miRNA and its application

The present invention discloses a rice blast resistance related miRNA, has a nucleotide sequence shown as SEQIDNO:1. The expression of miRNA was negatively related to the expression and regulation of rice blast resistance gene Pik2 H4, by inhibiting the expression of miRNA in the construction of blast resistant rice varieties have high.

【技术实现步骤摘要】
一种稻瘟病抗性相关的miRNA及其应用
本专利技术涉及一种miRNA，具体涉及一种与稻瘟病抗性相关的miRNA，及其在水稻抗稻瘟病中的应用。
技术介绍
水稻(OryzasativaL.)是世界上最重要的粮食作物之一，全球约有50％的人口以稻米作为主食。随着人口的增长，粮食需求量将逐年增加。由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻生产的主要限制因子之一，严重威胁着世界的粮食生产。全球每年因稻瘟病造成的产量损失达11％～30％。稻瘟病在水稻全生育期内均可发生，经常在水稻区造成巨大损失。长期的生产实践证明，通过鉴定和利用广谱抗性基因进行水稻抗病育种成为了防治病害的有效、经济的策略。然而，由于稻瘟病菌小种的遗传复杂性及易变性，新选育的抗病品种常常在推广3-5年后因为能侵染该品种的优势小种的形成而丧失抗性，从而使其失去利用价值。于是人们提出了不同的战略战术来培育具有持久抗性的水稻品种：一是利用分子标记将具有不同抗性谱的抗病基因聚合到一个水稻品种中以防止抗病性的退化，减少单一的选择压力，进一步利用分子标记辅助选择(Molecular-assisted-selection,MAS)来进行育种。因此，寻找及利用具有广谱、持久抗性的新抗源，结合新技术新方法培育抗性新品种，并结合合理的栽培布局，是解决稻瘟病抗性品种寿命短这一问题的主要途径。miRNA是一类内源性的、19～24个碱基长度的小分子非编码RNA，是真核生物基因表达中的一类负调控因子，它可以通过与靶基因mRNA分子完全或部分匹配，指导mRNA剪切或者抑制翻译等方式来调节植物基因的表达，参与调控植物生长发育各个方面以及逆境胁迫响应等生物学过程。在植物miRNA的研究中，较多的miRNA已于模式植物拟南芥、水稻中鉴定得到；通过构建miRNAcDNA文库、大规模测序及生物信息学等，多个与水稻生长发育、逆境胁迫等相关的miRNA也已被鉴定出来，miRBase数据库中共有超过700条水稻miRNA序列。Li等研究发现，miR160a、miR164a和miR168a受稻瘟病菌的显著诱导表达，miR396、miR827和miR1871等表达量下调，miR169a、miR172a和miR398b在抗病材料和感病材料中都表现为上调(LiY,LuYG,ShiY,WuL,XuYJ,HuangF,GuoXY,ZhangY,FanJ,ZhaoJQ,ZhangHY,XuPZ,ZhouJM,WuXJ,WangPRandWangWM.2014.MultiplericemicroRNAsareinvolvedinimmunityagainsttheblastfungusMagnaportheoryzae.PlantPhysiol.164(2):1077-92)。miRNA可通过调控相应的靶基因而在植物的抗病反应表现重要的调控作用。miRNA也直接调控植物抗性基因及蛋白，引起抗病防卫基因的表达，使其表达产物抑制病原菌生长。miRNA亦可直接靶切NBS-LRR类抗性基因，进而参与R基因介导的ETI，如nta-miR6019和nta-miR6020可以通过靶切TIR-NB-LRR类N基因参与烟草(Nicotianabenthamiana)对烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)的抗性；在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、番茄(Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、大豆(Glycinemax)、棉花(Gossypiumraimondii)和杨树中，miR482和miR2118通过靶切各类的NBS-LRR基因参与病原菌诱导的防卫反应。上述研究表明miRNA的调控与各个层级的抗病反应途径具有重要关系，miRNA能够调控某些抗病途径中的关键靶基因来抵御病菌的入侵。相反，病原菌为了反抗，细菌也会像病毒一样，进化出效应分子蛋白去抑制miRNA通路，削弱植物的抗病性。王兴军等专利技术的“利用人工MicroRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA”(中国专利CN102676510A)，公开了一种利用人工miRNA提高水稻抗黑条矮缩病毒的方法及其专用双链RNA，这些研究表明miRNA可用于增强植物抗病性。然而，关于miRNA水稻三大病害之一的稻瘟病抗病育种中的应用还未见报道。因此，克隆与稻瘟病抗病反应相关的miRNA将在不同分子水平上丰富植物抗病机理，且通过改造miRNA来进行抗病育种，为解决作物抗病性提供新思路，具有重要的应用价值。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种与抗稻瘟病相关的、来源于水稻的miRNA；并提供该miRNA在培育抗稻瘟病水稻新品种的应用。通过抑制该miRNA的表达，提高靶基因Pik2-H4的表达，从而提高水稻对稻瘟病菌的抗性。本专利技术稻瘟病抗性相关的miRNA记为T46，其具有如SEQIDNO:1所示的序列。本专利技术还提供了上述稻瘟病抗性相关miRNA的前体序列，其具有如SEQIDNO:2所示的序列。本专利技术上述miRNA或其前体序列可调控水稻抗稻瘟病基因表达。经实验证实，在稻瘟病菌侵染水稻时，本专利技术所述miRNA表达量呈现下调趋势。本专利技术上述miRNA的靶基因，即所述抗稻瘟病基因为Pik2-H4。Pik2-H4是一个NBS-LRR抗性基因，它位于Pik位点，该位点包含Pik1与Pik2两个基因，他们对于介导稻瘟病抗性缺一不可。本专利技术通过5’RACE实验证实，本专利技术的miRNA可以直接裂解Pik2-H4的mRNA，从而负调控Pik2-H4的表达。本专利技术还提供了上述miRNA或其前体序列在培育抗稻瘟病水稻中的应用。由于T46的靶基因为Pik2-H4，T46的表达量与Pik2-H4的表达量呈负相关。R基因在介导抗病反应发生时需要大量的Pik2-H4的表达才能使水稻表现抗病。Pik2-H4持续高水平表达，水稻表现出自我免疫甚至高抗，因此过表达T46后，Pik2的表达水平降低，水稻丧失抗性；相反，如果敲除T46，会使靶基因表达处于较高的水平，表现较高的抗性。在水稻中过表达T46或敲除T46的前体后的转基因植株的抗病表明，过表达T46使水稻更易感病，而敲除T46抑制T46基因的表达能使水稻对稻瘟病具有更好的抗性。本专利技术利用荧光定量PCR结果显示，miRNA-T46受稻瘟病菌调控，表达量呈现下调趋势。靶基因Pik2-H4在稻瘟病菌侵染后则出现上调表达的趋势，两者呈现负相关，进一步证实T46与Pik2-H4之间的调控关系，表明T46在水稻抗稻瘟病调控过程中的重要作用。本专利技术通过构建水稻T46的过表达载体，将该过表达载体质粒转化进土壤农杆菌侵染Pik-H4NIL的愈伤组织。对获得的转基因植株进行抗病性分析结果表明，过表达T46显著降低水稻对稻瘟病的抗性，进一步表明T46对Pik2-H4的重要调控作用，为后续研究奠定了重要基础。本专利技术通过构建miRNA-T46敲除用的CRISPR/Cas9敲除载体，将该载体质粒转化进土壤农杆菌侵染Pik-H4NIL的愈伤组织，获得阳性植株。利用荧光定量PCR检测阳性植株及DNA测序验证敲除植株。对获得的转基因水稻进行抗病性分析表明，转基因水稻植株能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稻瘟病抗性相关的miRNA，其特征在于，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种稻瘟病抗性相关的miRNA，其特征在于，具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述稻瘟病抗性相关miRNA的前体序列，其特征在于，具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。3.权利要求1所述miRNA或权利要求2所述前体序列在调控水稻抗稻瘟病基因表达中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王加峰，董双玉，孙大元，张景欣，陈志强，王慧，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44