本发明专利技术属于分子生物学和基因工程领域，涉及一种利用聚合酶扩增技术，从芹菜品种‘六合黄心芹’中获得一个与糖代谢相关的UDP基因。UDP基因编码UDP‑glucose iridoid glucosyltransferase酶，该酶是植物蔗糖代谢过程中重要的转化酶。本发明专利技术公开了一种从芹菜品种‘六合黄心芹’中克隆出UDP基因的方法，以及该基因的序列。
A method for obtaining UDP gene related to celery carbohydrate metabolism by polymerase chain amplification
【技术实现步骤摘要】
一种利用聚合酶扩增技术获得芹菜糖代谢相关UDP基因的方法
本专利技术属于分子生物学和基因工程领域，涉及一种利用聚合酶扩增技术，从芹菜品种‘六合黄心芹’中获得一个与糖代谢相关的UDP基因的方法。本专利技术公开了一种从芹菜品种‘六合黄心芹’中克隆出UDP基因的方法，以及该基因的序列。
技术介绍
芹菜(ApiumgraveolensL.)为伞形科草本植物，是重要的蔬菜作物之一。芹菜富含蛋白质、矿物质、胡萝卜素、维生素等多种营养成分。茎叶等营养组织，具有降低血压、调解血脂、抗氧化等药理功效。‘六合黄心芹’是南京市六合区的地方优良品种，株高较矮，株型半直立，具有产量高、品质好、抗逆性强、适应性广的特征，属于空心芹菜类型。糖是植物生命活动比如果实生长发育的基础物质，也作为信号分子，与激素、N等信号联成网络，通过复杂的信号转导机制调节植物生长发育与基因表达。蔗糖代谢关键酶主要为转化酶、葡糖糖转移酶、蔗糖合成酶以及蔗糖磷酸合酶，转化酶为分解蔗糖的酶，葡糖糖转移酶催化蔗糖转化，蔗糖合成酶进一步催化合成蔗糖磷酸，最后在磷酸酯酶作用下生成蔗糖。UDP-glucoseiridoidglucosyltransferase是植物蔗糖代谢过程中重要的转化酶，研究UDP基因在芹菜中的表达情况，可进一步研究芹菜的蔗糖代谢过程，并从糖代谢途径研究芹菜的品质等。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用聚合酶扩增技术，从芹菜品种‘六合黄心芹’中获得一个与糖代谢相关的UDP基因的方法，以及该基因的序列。所获得的基因有利于深入了解芹菜的蔗糖代谢过程，同时也可深入研究芹菜的品质等。该方法包括：芹菜总RNA的提取及cDNA的合成，芹菜UDP基因的扩增，芹菜UDP基因的回收、连接、转化与筛选，菌液检测，测序基因序列组装与分析。具体实施方式1.芹菜总RNA的提取及cDNA的合成。芹菜总RNA按照RNAsimpleTotalRNAKit(Tiangen公司，北京)试剂盒说明书提取，利用PrimeScriptRTreagentKit(TaKaRa公司，大连)试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA。2.芹菜UDP基因的扩增。根据本实验室测定的芹菜基因组数据，检索并拼接出芹菜UDP基因序列，设计一对引物，前引物：TACCTCTTAGTCTTTGATGGTTCTG；后引物：TCAAAATGCAAGATTAGCTCTGTT。以芹菜品种‘六合黄心芹’cDNA为模板进行扩增，PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃2min，共30个循环；72℃10min。4.芹菜UDP基因的回收、连接和转化。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，利用康宁生命科学(吴江)有限公司的AxyPrepTMDNAGelExtractionKit250-prep试剂盒说明书进行回收。连接反应采用5μL体系：2.5μLSolutionone、0.5μLPMD19、2μL回收产物。在PCR仪中16℃连接2.5h。随后，将连接产物利用42℃热击(1min)的方法，转化到大肠杆菌DH5α中。冰浴10min后，加入无抗性的LB液体培养基700μL，置于37℃摇床中，220rpm/min，复苏1h。5.大肠杆菌单菌落的筛选。将复苏好的菌液，12000rpm/min离心机离心5min，去除上清液，保留120μL底部菌液。于超净工作台上，使用200μL移液枪将菌液混匀，涂布于含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基中。倒置放入37℃的培养箱中，培养12～14h。挑取单菌落，接种于2mL离心管，含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，重复挑取5个单菌落，置于37℃摇床中，220rpm/min培养6～7h。6.菌液检测。以反应所得菌液为模板，利用PCR反应进行检测。反应体系为10μL体系：5μLTaq酶，3.5μL的ddH2O，菌液、前后引物各0.5μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃90s，共35个循环；72℃10min。利用凝胶电泳检测是否为目的条带。确认获得目的条带正确后，将3管菌液送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。7.测序基因序列组装与分析。通过核苷酸序列测定，获得了芹菜UDP基因的序列，利用BioXM2.6软件对其基因序列进行组装与分析，从而获得该基因的序列。最后，将获得的基因序列导入NCBIBLAST中进行序列比对，验证所获基因序列是否正确。试验结果：利用聚合酶扩增技术从芹菜品种‘六合黄心芹’中克隆出了一个与糖代谢相关的UDP基因，该基因序列长度为1359bp。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从芹菜品种‘六合黄心芹’中克隆出UDP基因的方法；
【技术特征摘要】
1.一种从芹菜品种‘六合黄心芹’中克隆出UDP基因的方法；2.权利要求1所述的芹菜品种‘六合黄心...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊爱生，张馨月，谭国飞，王枫，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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