在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途技术

本发明专利技术涉及在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途。具体地，本发明专利技术涉及在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和包含所述重组破囊壶菌的细胞培养物，以及使用所述重组破囊壶菌生产细胞培养物、生物质、微生物油、组合物和生物燃料的方法。

Recombinant capsular fungus and its composition, preparation and use on sucrose

The present invention relates to the recombinant bursa fungus growing on sucrose and its composition, preparation method and use. In particular, the invention relates to a recombinant bursa, which is grown on sucrose, and a cell culture containing the recombinant pouch fungus, and a method for producing cell culture, biomass, microbial oil, composition and biofuels using the recombinant pouch fungus.

【技术实现步骤摘要】
在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途本专利技术申请是基于申请日为2010年12月28日、申请号为201080064859.9(国际申请号为PCT/US2010/062277)、名称为“在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途”的专利技术专利申请的分案申请。涉及以电子方式提交的序列表将与本申请一起提交的以电子方式提交的序列表(“sequencelisting_ascii.txt”，77,186字节，2010年12月23日创建)的内容通过述及整体并入本文。相关申请的交叉引用本申请主张2009年12月28日提交的美国申请案第61/290,443号的申请日的权利，此处将其以整体引用的方式并入本文。专利技术背景
本申请涉及在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和包含所述重组破囊壶菌的细胞培养物，以及使用所述重组破囊壶菌生产细胞培养物、生物质、微生物油、组合物和生物燃料的方法。
技术介绍
脂肪酸基于碳链长度和饱和特性分类。根据存在于链中的碳的数目将脂肪酸称为短链、中链或长链脂肪酸，当碳原子间不存在双键时称为饱和脂肪酸，而当存在双键时称为不饱和脂肪酸。当仅存在一个双键时不饱和长链脂肪酸是单不饱和的，而当存在多于一个双键时是多不饱和的。多不饱和脂肪酸(PUFA)基于所述脂肪酸甲基末端的第一个双键的位置分类：Ω-3(n-3)脂肪酸在第三个碳处包含第一个双键，而Ω-6(n-6)脂肪酸在第六个碳处包含第一个双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是Ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，具有22个碳的链长和6个双键，通常标为“22:6n-3”。其他Ω-3LC-PUFA包括标为“20:5n-3”的二十碳五烯酸(“EPA”)和标为“22:5n-3”的Ω-3二十二碳五烯酸(“DPAn-3”)。DHA和EPA已被称为“必需”脂肪酸。Ω-6LC-PUFA包括标为“20:4n-6”的花生四烯酸(“ARA”)和标为“22:5n-6”的Ω-6二十二碳五烯酸(“DPAn-6”)。Ω-3脂肪酸是生物学上重要的分子，由于其存在于细胞膜而影响细胞生理学，调节生物活性化合物的生成和基因表达，且充当生物合成底物。Roche，H.M.，Proc.Nutr.Soc.58：397-401(1999)。例如，DHA占人大脑皮层中脂质的约15％-20％、并占视网膜中脂质的约30％-60％，其集中于睾丸和精子中，且是乳汁中的重要成分。Jean-PascalBergé和GillesBarnathan，“来自海洋生物脂质的脂肪酸：分子生物多样性，作为生物标记的作用，生物活性化合物和经济方面”(FattyAcidsfromLipidsofMarineOrganisms：MolecularBiodiversity，RolesasBiomarkers，BiologicallyActiveCompounds，andEconomicalAspects)，《海洋生物技术》(MarineBiotechnology)I49(T.Scheper编，2005)。DHA占大脑中Ω-3脂肪酸的多达97％和视网膜中Ω-3脂肪酸的多达93％。此外，DHA对胎儿和婴儿发育以及维持成人中的认知功能是必需的。同上。包括DHA和EPA在内的Ω-3脂肪酸还具有抗炎特性。参见例如同上以及Simopoulos，A.P.，J.Am.Coll.Nutr.21：495-595(2002)。特别的是，EPA与花生四烯酸竞争通过环氧合酶和脂氧合酶进行的二十烷类如前列腺素和白三烯的合成。同上。由于Ω-3脂肪酸不在人体内从头合成，这些脂肪酸必须获得自营养源。破囊壶菌(thraustochytrids)是破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物，其被认为是脂质生产的替代来源。例如，已经报道了破囊壶菌菌种的菌株以占该生物体所产生总脂肪酸的高百分比生成Ω-3脂肪酸。参见例如美国专利第5,130,242号；Huang，J.等，J.Am.Oil.Chem.Soc.78：605-610(2001)；和Huang，J.等，Mar.Biotechnol.5：450-457(2003)，以整体引用的方式并入本文。破囊壶菌还被认为是生产生物燃料的脂质来源。参见例如美国公开第2009/0064567号和WO2008/067605，以整体引用的方式并入本文。虽然破囊壶菌代谢葡萄糖和/或果糖，它们是蔗糖的两个糖成分，但是其似乎无法天然代谢蔗糖。参见，例如，Aki等，JAOCS80:789-794(2003)；Yokochi等，Appl.Microbiol.Biotechnol.49:72-76(1998)；Honda等，Mycol.Res.4:439-448(1998)；Singh,WorldJ.ofMicrobiology12:76-81(1996)；Goldstein,AmericanJ.ofBotany50:271-279(1963)；和美国专利第5,340,742号。由此，破囊壶菌培养，包括商业和工业培养，目前需要葡萄糖浆作为碳源和能源，而不是更廉价的含有蔗糖的碳水化合物来源。对于产生能够在替代碳源如蔗糖上生长的破囊壶菌以在商业和工业应用中使用的需求一直存在。专利技术概述本专利技术涉及一种生产破囊壶菌细胞培养物的方法，包括：(a)以包含编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞，并(b)在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养转化的破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，蔗糖酶是转化酶。在一些实施方案中，蔗糖酶可操作地与信号肽连接。在一些实施方案中，编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90％相同的：编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以供在裂殖壶菌属(Schizochytrium)中表达；和SEQIDNO:1或SEQIDNO:4的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以包含编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90％相同的：登录号L47346或X69165的多核苷酸序列；和经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达的登录号L47346或X69165的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属(Thraustochytrium)的。在一些实施方案中，本专利技术涉及通过所述方法生产的破囊壶菌细胞培养物。本专利技术也涉及包含含有编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列的核酸分子的破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，蔗糖酶是转化酶。在一些实施方案中，蔗糖酶可操作地与信号肽连接。在一些实施方案中，编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90％相同的：编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达；和SEQIDNO:1或SEQIDNO:4的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述细胞进一步包含编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，编本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产破囊壶菌(thraustochytrid)细胞培养物的方法，该方法包括：(a)以包含编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞，并(b)在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养转化的破囊壶菌细胞。

【技术特征摘要】
2009.12.28 US 61/290,4431.一种生产破囊壶菌(thraustochytrid)细胞培养物的方法，该方法包括：(a)以包含编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞，并(b)在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养转化的破囊壶菌细胞。2.依照权利要求1所述的方法，其中所述蔗糖酶是转化酶。3.依照权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述蔗糖酶可操作地与信号肽连接。4.依照权利要求1-3任一项所述的方法，其中编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90％相同的：编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以供在裂殖壶菌属(Schizochytriu...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·C·利普梅尔，K·E·埃普特，J·M·汉森，
申请(专利权)人：DSMIP资产公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL