按植物偏爱密码子合成降钙素基因及其在植物中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种按植物偏爱密码子设计合成的编码降钙素的基因。涉及包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体。该表达载体具有在普通植物中高效表达的特性。还涉及被所说的表达载体转化的植物细胞，以及由所说的转化细胞产生的表达降钙素的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明专利技术还提供了在样品中检测降钙素核酸序列和多肽的方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本专利技术涉及一种首次根据植物偏爱密码子设计人工合成的降钙素(Calcitonin，CT)的核酸序列。本专利技术还涉及降钙素在植物中的表达。本专利技术中，我们用化学合成法，首次根据植物偏爱密码子设计了可以在植物中表达的具有生物活性的降钙素及其编码序列。在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的在植物中表达的降钙素编码序列。本专利技术的第二目的是提供一种在植物中表达的降钙素。本专利技术的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述新的降钙素的蛋白及核酸序列的方法。本专利技术还提供了这种新的降钙素和编码序列的应用。在本专利技术的一个方面，提供了一种人工设计并合成的含有新的降钙素基因的克隆载体pGEM-5zf-ct，该载体包括根据植物偏爱密码子设计的降钙素的核酸序列，所述的核酸序列与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-113位DNA分子的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-113位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-113位的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种在植物中表达的降钙素，它包括具有SEQ IDNO.6氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.6序列的多肽。在本专利技术的另一方面，还提供了几种表达载体，它包含上述的DNA分子。在本专利技术的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是烟草和番茄。在本专利技术的另一方面，还提供了一种在植物中产生和表达具有活性的降钙素的方法，其步骤如下(1)将人工合成的编码具有降钙素活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成降钙素蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-113位的核苷酸序列有至少85％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成降钙素的重组细胞；(3)在适合表达降钙素的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)再生重组细胞，获得表达降钙素的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.5中第18-113位的序列。在本专利技术中，术语“降钙素编码序列”指编码具有降钙素活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.5中第18-113位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.5序列的编码框第18-113位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所有与SEQ ID NO.5中第18-113位核苷酸序列同源性低至约85％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.6所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-113位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-113位的核苷酸序列的同源性至少85％，较佳地至少90％，更佳地至少95％，最佳地至少99％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的降钙素相同功能的蛋白的SEQ ID NO.5中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本专利技术中，术语“降钙素”指具有降钙素活性的SEQ ID NO.6序列的多肽。该术语还包括具有与降钙素在植物中表达相同功能的SEQ ID NO.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为15个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的在植物中偏爱的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个植物偏爱密码子所表达的氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括在植物中的表达的降钙素的活性片段和活性衍生物。本专利技术的降钙素的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与降钙素DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗降钙素的抗血清获得的多肽或蛋白。在本专利技术中，“降钙素保守性变异多肽”是指与SEQ ID NO.6的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1 本专利技术还包括人工合成的在植物中表达的降钙素或多肽的类似物。这些类似物与降钙素的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本专利技术的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本专利技术中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在生产本专利技术的在植物中表达的降钙素时，可以将降钙素编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成降钙素表达载体。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本专利技术中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞、番茄细胞及其它植物细胞。还可用Nothern印迹法技术分析降钙素基因产物的表达，即分析降钙素的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。降钙素RNA的Nothern印迹分析和特异抗体的降钙素Western印本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工合成的ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：根据植物偏爱密码子设计的编码具有降钙素活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５中从核苷酸第１８－１１３位的核苷酸序列有至少８５％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５中从核苷酸第１８－１１３位的核苷酸序列杂交。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，庞永珍，孙小芬，赵凌侠，左开井，赵秀云，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]