细胞测试体系及构建方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种细胞测试体系及构建方法和用途。细胞测试体系是ＣＨＯ－Ｋ１／ｄ２ＥＧＦＰ和ＨＥＫ－２９３／ｄ２ＥＧＦＰ细胞系，并且其中包含由４ｘＣＲＥ和ＨＳＶ－ＴＫ的ＤＮＡ序列所构建的４ｘＣＲＥ－ｄ２ＥＧＦＰ质粒。细胞测试体系构建方法是设计４ｘＣＲＥ－ＨＳＶ－ＴＫ序列，人工合成相应的寡核苷酸；以该寡核苷酸为模板，设计引物进行ＰＣＲ扩增并克隆到ｄ２ＥＧＦＰ载体上；测序鉴定连接产物，挑选出正确的重组质粒，将质粒转入ＣＨＯ－Ｋ１和ＨＥＫ－２９３细胞中；用Ｇ４１８抗生素筛选抗性克隆并进行功能测试。细胞测试体系的用途是用于筛选与ｃＡＭＰ信号传导途径相互作用的化合物。本发明专利技术的优点是：灵敏度高，特异性强，检测方便，经济，易于观察，可应用于大规模药物筛选，缩短药物研发周期，减少研发费用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞生物学和分子生物学领域，尤其涉及细胞测试体系及构建方法和用途。
技术介绍
在这2种细胞模型中，我们应用了一种名为d2EGFP的报告基因。GFP(greenfluorescent protein)绿色荧光蛋白是来自水母的的基因报告分子，可用于活体、原位、即时的检测基因表达及蛋白定位，不需要附加蛋白或底物，GFP在蓝光激发下会发出明亮的绿色荧光。GFP荧光稳定，不依赖于物种，对活细胞没有损害。对GFP改进得到EGFP(enhanced green fluorescent protein)激发出的荧光比野生型GFP强约35倍，选用人类偏爱的密码子使表达量提高。d2EGFP是在EGFP的基础上对其进行了改造，由EGFP融合了小鼠鸟氨酸脱羧酶(MODC)的422-461氨基酸残基而来，MODC的422-461区域含有PEST功能域，能够促使蛋白降解，在不降低表达强度的前提下减小了半衰期。哺乳动物中EGFP的表达非常稳定，超过24小时。而d2EGFP的半衰期仅为2个小时。d2EGFP蛋白可以用于精确测定启动子调节的mRNA转录，基因表达。我们所用的2种细胞系分别是CHO-K1细胞系和HEK-293细胞系。CHO-K1细胞系是中国仓鼠卵巢细胞系，HEK-293是人胚胎肾细胞系。二者均为贴壁生长的细胞系。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种细胞测试体系及构建方法和用途。细胞测试体系是CHO-K1/d2EGFP和HEK-293/d2EGFP细胞系，并且其中包含由4xCRE和HSV-TK的DNA序列所构建的4xCRE-d2EGFP质粒。细胞测试体系构建方法的步骤如下1)设计4xCRE-HSV-TK序列，人工合成相应的寡核苷酸；2)以合成的4xCRE-HSV-TK寡核苷酸为模板，设计引物扩增出相应的PCR产物；3)将上述的PCR产物克隆到d2EGFP载体上；4)测序鉴定连接产物，挑选出正确插入有4xCRE-HSV-TK序列的重组质粒，构建的质粒命名为4xCRE-d2EGFP； 5)将4x CRE-d2EGFP转入CHO-K1和HEK-293细胞中；6)用G418抗生素筛选转染的CHO-K1和HEK-293细胞，直至出现抗性克隆；7)挑选出抗性细胞克隆；8)对筛选的细胞克隆进行功能上的测试。细胞测试体系的用途是用于筛选与cAMP信号传导途径相互作用的化合物。本专利技术的优点是灵敏度高，特异性强，检测方便，经济，易于观察，可应用于大规模药物筛选，缩短药物研发周期，减少研发费用。附图说明附图是构建细胞模型的原理图。具体实施例方式我们首先构建4xCRE-d2EGFP质粒(4x即重复4次)，将4xCRE连同HSV-tk启动子克隆入报告基因d2EGFP上，HSV-tk(Herpes simplex virus thymidinekinase)是单纯疱疹病毒胸苷激酶。构建出的质粒转化CHO-K1与HEK-293细胞系，用G418筛选，挑选出克隆鉴定，阳性克隆加入foscolin刺激后(foscolin是一种植物提取物，具有使细胞中cAMP浓度升高的作用)，5个小时后荧光显微镜下观察可见有绿色荧光。我们成功的构建了可供药物筛选及研究的报告基因细胞测试体系。这2种测试体系可以用来检测细胞中cAMP浓度的变化，所有基于cAMP信号转导路径的GPCR(G protein coupled receptor)(G蛋白偶联受体)都可用此模型来筛选激动剂以及拮抗剂。从筛选出化合物中，有望找出有价值的药物。此模型灵敏度高，特异性强。检测方便，经济，易于观察。构建报告基因细胞测试体系的方法为1)设计4xCRE-HSV-TK序列，人工合成相应的寡核苷酸。2)以合成的4xCRE-HSV-TK寡核苷酸为模板，设计引物扩增出相应的PCR产物。3)将上述的PCR产物克隆到d2EGFP载体上。4)测序鉴定连接产物，挑选出正确插入有4xCRE-HSV-TK序列的重组质粒，构建的质粒命名为4xCRE-d2EGFP。5)将4x CRE-d2EGFP转入CHO-K1和HEK-293细胞中。6)用G418抗生素筛选转染的CHO-K1和HEK-293细胞，直至出现抗性克隆。7)挑选出抗性细胞克隆。8)对筛选的细胞克隆进行功能上的测试。首先，本专利技术设计一段DNA序列，此序列含有4xCRE序列和HSV-TK序列，CRE(cAMP response element)是与磷酸化的CREB蛋白结合的DNA序列，4x即重复4次。HSV-TK是单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子，可用于启动基因在哺乳动物中表达，表达强度为中等。对这部分DNA序列的设计是本专利技术的关键之处，人工合成相应的寡核苷酸。根据本专利技术所公开的有关核苷酸序列来设计引物，引物设计的时候在5’端加上了BamH I酶切位点序列以方便连接到其它的载体上。以合成的4xCRE-HSV-TK寡核苷酸为模板，扩增出相应的PCR产物。在此基础上，本专利技术将上述的PCR产物克隆到d2EGFP载体上。d2EGFP载体含有编码d2EGFP的DNA序列，在d2EGFP基因的上游没有启动子，方便因不同的需要而插入各种启动子。该载体上有编码新霉素(neomycin)的基因可用于真核细胞筛选标记，同时也可以作为原核细胞的筛选标记，可以用卡那霉素来筛选。连接的过程首先要BamH I内切酶将d2EGFP载体上切成线性，并用同样的内切酶作用PCR产物，然后将酶切后的产物以适当比例混合，在T4连接酶的作用下完成连接。将上述的连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布到含有卡那霉素的平板上。随机挑选菌落，小量扩增培养并提取质粒，测序鉴定插入有4xCRE-HSV-TK序列的阳性质粒。克隆成功的质粒应含有4xCRE-HSV-TK序列，位于d2EGFP基因的上游并与设计的序列完全一致，将其命名为4x CRE-d2EGFP。该质粒包含本专利技术的4xCRE序列，以及HSV-tk启动子和d2EGFP报告基因。本专利技术进一步地将4xCRE-d2EGFP转入CHO-K1细胞中和HEK-293细胞中，二者均为贴壁生长的细胞系。CHO-K1细胞应用F12培养基+10％胎牛血清培养，每隔2-3天更换一次培养液。HEK-293细胞应用DMEM培养基+10％胎牛血清培养，每隔2-3天更换一次培养液。二者均用0.25％胰蛋白酶消化传代。转染的方式可以用脂质体方法，磷酸钙方法，电转化等转染方式。在本专利技术中，我们应用的是脂质体转染的方法。转染后的细胞可以用G418抗生素筛选出抗性克隆。G418是一种类新霉素的氨基糖苷，可以抑制原核和真核细胞蛋白合成，4xCRE-d2EGFP载体上含有neomycin抗性基因，因此G418可以用来筛选稳定转染4xCRE-d2EGFP质粒的细胞。于转染后2天在CHO-K1细胞中和HEK-293细胞中加入G418(600ug/ml)，每隔2到3天更换一次培养液，直至出现抗性克隆。挑取若干个抗性克隆到96孔板上继续培养，待细胞达到一定数目后进行功能上的测试，具体方法是加入foskolin(10uM)，foscolin是一种植物提取物，具有使细胞中cAMP浓度升高的作用。5个小时后在荧光显微镜下观察，比较加入foskolin前后荧光强度的改变。可以观察到未加入fos本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞测试体系，其特征在于它是ＣＨＯ－Ｋ１／ｄ２ＥＧＦＰ和ＨＥＫ－２９３／ｄ２ＥＧＦＰ细胞系，并且其中包含由４ｘＣＲＥ和ＨＳＶ－ＴＫ的ＤＮＡ序列所构建的４ｘＣＲＥ－ｄ２ＥＧＦＰ质粒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阎东升，董伟，谈学海，胡咏武，汪建，
申请(专利权)人：杭州华大基因研发中心，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]