乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片及其制备方法，芯片包括基片和阵列式分布的肽核酸探针与对照的点涂层，基片是玻璃基片，尼龙膜之一；肽核酸探针与对照的点涂层是指含有乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知突变位点和野生位点的２４条检测探针，２条阳性对照探针，１条阴性对照探针及空白点样液对照；乙肝病毒ＤＮＡ样品的ＰＣＲ扩增利用带有Ｔ３启动子的引物，ＰＣＲ产物经体外转录进行荧光标记，所得单链ＲＮＡ经片段化与肽核酸芯片杂交，由杂交信号的强弱来分析突变位点。本芯片同时平行检测乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知的突变位点，具有快速、高效、诊断精确的特点。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因芯片领域，具体地是涉及肽核酸低密芯片及其制备方法，尤其是涉及乙肝突变位点的肽核酸检测芯片及其制备方法。肽核酸最早是在1991年由彼得等人合成的一种用于反义、抗基因治疗的核酸类似物。它是由N-(2-氨基乙基)甘氨酸替代DNA分子中的磷酸戊糖骨架，四种碱基通过亚甲基羰基与骨架相连。肽链骨架的引入，赋予了PNA独特的理化和生物学特性。PNA在分子生物学领域前景非常广阔，它已被用于增强的PCR扩增、PNA胶前杂交(pre-gelhybridization)、PNA辅助剪切(PNA-assisted rare cleavage)、核酸纯化、采用PCR发夹(PCR clamping)分析单碱基突变，用PNA作探针通过毛细管电泳检测遗传突变，发展PNA衍生物，生物传感器等领域。肽核酸为非手性分子、不带电荷，稳定性高、不易被蛋白酶和核酸酶所降解、在很宽的pH值范围内稳定，与核酸的结合遵循瓦斯顿-克瑞克(Waston-Crick)碱基互补配对原则。由于PNA含中性骨架，链间无排斥作用，它与DNA、RNA所形成的杂交体热稳定性要比相应的RNA-RNA、DNA-DNA、DNA-RNA高。10-mer的PNA与相对应的DNA杂交所形成的反向平行二聚体的Tm值为50℃，15-merPNA的Tm值为70℃。PNA的结合特异性也要高于DNA和RNA，15-mer PNA/DNA中一个碱基的差异就可使Tm值下降8-20℃(平均为15℃)，而相应的DNA/DNA Tm值下降为4-16℃(平均为11℃)。而且PNA的杂交不依赖于高盐离子强度，只需低的盐离子强度。考虑到PNA的配对、结合和杂交等特性，PNA探针在识别单碱基突变、微阵列等方面具有广阔的前景。肝炎是世界性传染疾病，我国是公认的肝炎大国，肝炎的患病率和发病率都居世界前列。乙肝病毒基因不同位点的突变可引起免疫逃避、抗病毒治疗逃避，使得临床检测出现漏检、用药不当，以至延误治疗。本专利技术采用标记的RNA和肽核酸芯片杂交来检测乙肝突变位点，能提高检测的灵敏度和特异性，至今未见报道。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术要解决的问题是提供一种，并同时公开乙肝已知突变位点的肽核酸检测探针和阴、阳性对照探针，用于PCR扩增的上、下游引物。该肽核酸检测芯片具有快速、高效、准确、平行诊断的特点，能为临床用药、治疗提供重要依据。本专利技术的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，包括基片和阵列式分布的肽核酸探针与对照的点涂层，基片是玻璃基片，尼龙膜之一。肽核酸探针与对照的点涂层是指在基片上均匀分布的，含有乙肝前核心抗原区(前C区)和表面抗原区(S区)已知突变位点和野生位点的24条检测探针，2条阳性对照探针，1条阴性对照探针及空白点样液对照。上述的基片是未经任何修饰的玻璃裸片、醛基化玻璃片、氨基化玻片和尼龙膜之一。上述醛基化玻片采用饱和碳酸氢钠溶液作为点样液，氨基化、未经任何化学修饰的玻璃裸片和尼龙膜采用杂交液作为点样液。上述的肽核酸探针所在阵列与对照的点涂层的大小，可以根据点的大小，点间距的变化而变化，阵列在基片上的分布数目可根据待分析样品的数目而变化。上述的肽核酸探针排列如附图2所示，肽核酸探针点直径为100μm，点间距为300μm时，肽核酸探针所在阵列与对应的点涂层大小为1.6mm×1.6mm。上述的肽核酸检测探针，包括乙肝表面抗原区已知的5个突变位点546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原区已知的7个突变位点1896G-A、1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901 G-A；突变位点肽核酸检测探针12条，野生位点肽核酸检测探针12条，合计肽核酸检测探针24条。上述的2条阳性肽核酸对照探针，分别源于前核心抗原区和表面抗原区的核酸保守序列。上述的阴性肽核酸对照探针源于人ATM基因中的17mer核酸序列。上述的肽核酸探针是长度为14-18mer的肽核酸，均设计在乙肝病毒DNA反义链，其氨基末端连有O-连接子(O-1inker，8-amino-3，6-dioxaoctonic acid)，对应着DNA链的3′端。本专利技术乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片的制备方法包括以下步骤1、肽核酸PNA检测探针的设计及合成肽核酸探针的长度为14-18mer，均设计在乙肝DNA反义链。突变检测位点尽可能设计在肽核酸探针的中间位置，所有探针的Tm值按GC碱基百分比计算，相差不超过10℃。其氨基末端连有O-连接子，对应着DNA链的3′端，即PNA与样品DNA以反向平行方式结合。该芯片所用肽核酸探针及其序列见表1。PNA探针由德国麦德堡(MetabionGmbH)公司合成。2、玻片的修饰与PNA探针的固定用含1％-5％3-氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮溶液处理玻璃载玻片，即得到氨基化玻片。氨基化玻片经5％-25％的戊二醛溶液处理2-5小时后，得到醛基化玻片。肽核酸含有氨基端，通过希佛氏碱反应与醛基化玻璃基片结合。醛基化玻片采用饱和的NaHCO3溶液作为点样液，氨基化、未经任何化学修饰的玻璃裸片和尼龙膜采用杂交液，即pH7.0的10mM的磷酸盐缓冲液(0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS)作为点样液。3、乙肝样品DNA的提取、PCR扩增和荧光标记1)DNA提取取20-100μl乙肝血清，加入3倍体积的裂解液，混匀。加入等体积的氯仿、异戊醇溶液(24∶1)，离心后向吸取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，冷冻后离心，所得沉淀用70％的乙醇清洗2次。2)PCR扩增所采用的PCR上下游引物分别为上游引物5′ATTAACCCTCACTAAAGGGGAGGCATACTTCAAAGACTGT 3′T3启动子序列下游引物5′GATGGGATGGGAATACA 3′上游引物起始于乙肝病毒DNA正义链的1700位点(起始位点是以GeneBank号为AF100308的乙肝病毒DNA为参考)，长度为21个碱基，5′端连有19个碱基的T3启动子序列。下游引物的长度为17个碱基，起始于乙肝病毒DNA正义链的601位点。PCR扩增区域为2133bp，包括了前C区与S区所有已知突变位点。PCR扩增采用美国MJ Research PTC-225PCR扩增仪，扩增体系为25μl。程序如下94℃ 1.5min 1个循环94℃ 20sec、 55℃ 20sec、72℃ 2.5min共计35个循环72℃ 8min 1个循环所得PCR扩增产物经玻璃奶纯化。3)体外转录标记采用普洛麦格(Promega)公司商用试剂盒，在T3体外转录中加入Cy3-UTP标记。4、肽核酸阵列的杂交和检测，信号分析体外转录得到的RNA经片段化后与肽核酸阵列杂交。杂交温度为65℃-85℃，时间为1-3个小时。杂交液采用10mM的磷酸盐缓冲液pH7.0，内含0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS。清洗液采用10mM的磷酸盐缓冲液洗1次，5mM的磷酸盐缓冲液洗2次。杂交后的肽核酸芯片经激光扫描仪扫描或荧光显微镜观察并收集信号，依据扫描分析或荧光定量，阴性对照和点样液对照无荧光信号，阳性对照探针有荧光信号。根据各位点野生型和突变型探针荧光信号本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，包括基片和阵列式分布的肽核酸探针与对照的点涂层，其特征在于，所述的基片是玻璃基片，尼龙膜之一；所述的肽核酸探针与对照的点涂层是指在基片上均匀分布的，含有乙肝前核心抗原区、表面抗原区已知突变位点和野生位点的２４条检测探针，２条阳性对照探针，１条阴性对照探针及空白点样液对照。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩金祥，鲁艳芹，
申请(专利权)人：山东省医药生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]