罗氏沼虾诺达病毒核酸点杂交检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种罗氏沼虾诺达病毒核酸点杂交检测的方法，其步骤是：首先是探针的制备；其次是样品处理；第三是预杂交和杂交；第四洗涤；第五是封闭；第六是抗体抗原反应；第七是洗涤；第八是显色反应；最后终止反应。本发明专利技术灵敏度高，成本低，适合于罗氏沼虾肌肉白浊病病原的诊断以及亲虾、幼苗和成虾的健康状态检测。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于虾类病害检测
，具体涉及一种，适用于罗氏沼虾肌肉白浊病病原的诊断。参考文献(1)Arcier J.M.，Herman F.，Lightner D.V.，Redman R.M.，Mari J.&Bonami J.R.(1999).A viral disease associated with mortalities in hachery-reared postlarvaeof the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii.Diseases ofAquatic Organisms，38，177-181. (2)Bonami J.R.(2002)A new viral disease in the giant freshwater prawnMacrobrachium rosenbergii.World Aquaculture 2002.Annual Meetings of theWorld Aquaculture Society and the China Society of Fisheries，April 23-27，2002.Beijing Convention Center，Beijing China.Abstract，p.79. (3)钱冬 杨国梁 刘问等。罗氏沼虾苗肌肉白浊病病原研究。水生生物学报，2002，26472-476(4)Romestand B.& Bonami J.R.(2002)A sandwich enzyme linked immunosorbentassay(S-ELISA)for detection of MrNV in the giant fresh water prawnMacrobrachium rosenbergii.Journal of Fish Diseases，(in press). (5)Tung C.W.，Wang C.S.& Chen S.N.(1999)Histological and electronmicroscopic study on Macrobrachium muscle virus(MMV)infection in the giantfreshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii(de Man)，cultured in Taiwan.Journal of Fish Diseases，22，1-5. 参考资料(1)、(2)(3)和(5)主要侧重于罗氏沼虾肌肉白浊病的病原研究，在组织病理、病毒的超微结构和生化特征的水平上对病毒进行描述。资料(4)报道了一种罗氏沼虾诺达病毒的免疫检测方法，该方法操作简单、快速，但灵敏度低。为了达到以上目的，本专利技术采取以下技术方案(1)制备试剂盒试剂盒含有所有检测程序中的必要成分，包括病毒核酸探针、样品处理液、杂交液，封闭液、抗地高辛抗体、洗涤液、显色剂、阳性对照、阴性对照、1.5ml离心管、杂交膜、杂交带、研磨小棒。(2)建立最佳的杂交反应体系。包括组织取材部位(整个幼苗或附肢)，最佳探针浓度(30-50ng/ml)，杂交温度(42℃)，杂交液系统(杂交液采用50％甲醛，0.05M磷酸钠2×SSC，2％封闭液，7％十二烷基硫酸酸钠，0.1％十二烷基肌氨酸钠)。本专利技术主要技术难点(1)特异性病毒核酸探针的制备。地高辛探针的制备用多聚酶链反应扩增(PCR)方法。在100μl反应体积内加入10μl 10x缓冲液，7μl 25mM氯化镁，10μl地高辛核甘酸混合物，2μl l0μM的上下游质粒通用引物(上游引物cgccagggttttcccagtcacgac；下游引物gagcggataacaatttcacacagg)，1μl耐高温核糖核甘酸聚合酶(Tag DNA聚合酶)，1μl含罗氏沼虾诺达病毒基因组(cDNA)片段的质粒DNA(10-50ng)。PCR结束后，在PCR产物中加入10μl 200μM乙二胺四醋酸，pH8.0、1μl 4M氯化俚和2倍体积的无水乙醇沉淀并干燥DNA，然后溶在50μl的无菌蒸馏水中。(2)组织样品处理。(整个幼苗或成虾的附肢)，放入1.5ml的离心管内，加入样品处理液(1∶10重量/体积)，用研磨小棒研磨直至组织被研碎。低速离心(3000g)后取上清1μl按1∶5稀释，70℃处理15min并迅速放置冰上。(3)点杂交程序的优化。首先是探针浓度的确定，合适的探针浓度为30-50ng/ml杂交液；其次是杂交液的选择，杂交液采用50％甲醛，0.05M磷酸钠2xSSC，2％封闭液，7％十二烷基硫酸酸钠，0.1％十二烷基肌氨酸钠；再次是杂交温度的选择，根据杂交液成分和病毒核酸性质，42℃为最佳杂交温度。本专利技术与现有技术相比有以下优点灵敏度高，能检测出少于26ng的病虾组织中的诺达病毒和少于2.5ng的病毒RNA；样品处理程序简单；不需要特殊昂贵的仪器；成本低；可以同时检测多个样品。(2)探针的制备地高辛探针的制备用常规PCR方法，将PCR产物标记上地高辛。扩增引物来自质粒通用引物，构建罗氏沼虾诺达病毒cDNA文库。(3)样品处理称取样品(幼苗整个或成虾的鳃)，放入1.5ml的离心管内，加入样品处理液(1∶10重量/体积)，样品处理液为焦碳酸二乙酯处理的缓冲液，缓冲液配方为0.02M三氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，0.4M氯化钠(NaCl)，pH7.4)，用研磨小棒研磨直至组织被研碎。低速离心(3000g)后取上清1μl按1∶5稀释，70℃处理15min并迅速放置冰上。取不同稀释度的点杂交样品1μl，点在带正电荷的尼龙膜上，紫外灯下处理3min。(4)预杂交和杂交将杂交膜放入杂交带内，加入预杂交液使杂交膜被溶液覆盖，预杂交液为50％甲醛，0.05M磷酸钠2×SSC，2％封闭液，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.1％十二烷基肌氨酸钠，封闭好杂交带，在42℃预杂交1-4小时。然后用预杂交液稀释探针(30-50ng/ml)，向杂交带内加入探针杂交液，42℃杂交过夜。(5)洗涤将杂交膜放在干净的平皿内，用洗涤液在室温条件下洗涤2次，洗涤液为2×SSC，0.1％SDS，每次15min。将杂交膜重新放回干净的杂交带内，用洗涤液，洗涤液为0.1×SSC，0.1％SDS，在68℃洗涤2次，每次15min。(6)封闭弃洗涤液，洗涤液为0.1×SSC，0.1％SDS，加入缓冲液，缓冲液为1％封闭液，室温下孵育30min。(7)抗体抗原反应用缓冲液稀释抗地高辛抗体(1∶5000稀释)，缓冲液为1％封闭液，放入杂交带内，室温下孵育30min。(8)洗涤取出杂交膜放在干净的平皿内，用缓冲液在室温下连续洗涤2次，缓冲液为100mM马来酸(Maleic acid)，150mM Nacl，pH7.5(20℃)，每次15min。(9)显色用缓冲液配置显色底物(2ml缓冲液中加入9ul氯化硝基四氮唑蓝盐(NBT)和7ul 5-溴-4氯-3吲哚磷酸盐(BCIP)。缓冲液为100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM MgCl2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种罗氏沼虾诺达病毒核酸点杂交检测的方法，包括下列步骤：（１）制备试剂盒：包括病毒核酸探针、样品处理液、杂交液，封闭液、抗地高辛抗体、洗涤液、显色剂、阳性对照、阴性对照、１．５ｍｌ离心管、杂交膜、杂交带、研磨小棒；（２）探针的制备： 地高辛探针的制备用常规ＰＣＲ方法，将ＰＣＲ产物标记上地高辛，扩增引物来自质粒通用引物，构建罗氏沼虾诺达病毒ｃＤＮＡ文库；（３）样品处理：称取样品，放入１．５ｍｌ的离心管内，加入样品处理液，用研磨小棒研磨直至组织被研碎，低速离心后取上清１ μｌ按１∶５稀释，７０℃处理１５ｍｉｎ并放置冰上；（４）预杂交和杂交：将杂交膜放入杂交带内，加入预杂交液使杂交膜被溶液覆盖，封闭好杂交带，在４２℃预杂交１－４小时，然后杂交带内加入探针杂交液，４２℃杂交过夜；（５）洗涤：将杂交膜放在 干净的平皿内，用洗涤液在室温条件下洗涤２次，将杂交膜重新放回干净的杂交带内，加入洗涤液在６８℃洗涤２次，每次１５ｍｉｎ；（６）封闭：弃洗涤液，加入１％封闭液，室温下孵育３０ｍｉｎ；（７）抗体抗原反应：用缓冲液稀释抗地高辛抗体，放入杂 交带内，室温下孵育３０ｍｉｎ；（８）洗涤：取出杂交膜放在干净的平皿内，用缓冲液在室温下连续洗涤２次；（９）显色：用缓冲液配置显色底物，将杂交膜放在干净的杂交带内，放入显色底物覆盖杂交膜，在避光处显色，肉眼观察结果，显棕色为弱阳性反应 ，蓝紫色为强阳性反应；（１０）终止反应；弃显色液，终止液，记录结果。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：石正丽，宝纳米简罗伯特，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]