石斑鱼病毒性神经坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供一种石斑鱼病毒性神经坏死病毒（ＶＮＮＶ，ＶｉｒａｌＮｅｒｖｏｕｓＮｅｃｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ）的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以根据病毒性神经坏死病毒保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。本发明专利技术采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，对病毒性神经坏死病毒的特异性ＤＮＡ核酸片段进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于石斑鱼各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水生经济动物病害的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对石斑鱼病毒性神经坏死病毒(VNNV，Viral Nervous Necrosis Virus)基因诊断的试剂盒及检测方法。早期快速诊断石斑鱼病毒性神经坏死病毒(VNNV，Viral Nervous Necrosis Virus)是目前石斑鱼养殖的主要预防措施和减少石斑鱼损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大水产养殖者急切盼望的。多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快被应用于实践中。本专利技术的石斑鱼病毒性神经坏死病毒的基因诊断试剂盒包括下列部件1).RNA提取液A液，2管，内装Trizol液；2).B液，1管，内装氯仿；3).C液，1管，内装异戊醇；4).D液，1管，内装70％乙醇；5).E液，1管，内装DEPC水；6).RT反应液F液，1管，内装RT反应液，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H2O、随机引物、RNA酶抑制剂RNAsin RI、反转录酶M-MLV RT；7).RT-PCR反应液G液，1管，内装RT-PCR反应液，包括10×Buffer(含mg2+)、dNTP、正向引物F1、反向引物R1、ddH2O和TaqE；8).阳性对照H液，1管，内装VNNV阳性模板；9).盒子；10).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。上述VNNV基因诊断试剂盒中所述的内外两对引物是根据VNNV基因保守区序列设计的，其DNA序列分别如下F15’-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CTR15’-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA用本专利技术上述试剂盒检测石斑鱼病毒性神经坏死病毒的方法，按下列步骤进行1).取样品加A液稀释稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆，室温静置3～5min；2).在上述匀浆液中加入200μlB液，上下颠倒混匀，静置5～10min；3).4℃，10000～12000r/min离心10～15min；4).取400μl上清，加入到500μlC液中，轻轻晃动，静置10～15min；5).4℃，10000～12000r/min离心10～15min；6).弃上清，用1ml预冷的D液洗涤2次，4℃，7500～10000r/min离心5～10min；7).空气干燥或在超净工作台上吹干，加50μlE液水溶解(若不能完全溶解可于55～60℃放置10～15min)，得到RNA提取液(可于-20℃保存)；8).RNA提取液在95℃预热5～10min；9).取2μl预热的RNA提取液，加入到F液中，37℃孵育1h。然后95℃水浴5～10min使失活，得到RT-PCR反应模板；10).分别取模板和H液加入到G液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；11).按下列条件扩增95℃ 10min预变性，→94℃40sec 35个循环→72℃7min→4℃保存55℃ 40sec72℃ 40sec12).反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在426bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为VNNV阳性，说明待测样品携带病毒性神经坏死病毒，否则为阴性。本专利技术的有益效果本专利技术的石斑鱼病毒性神经坏死病毒的基因诊断试剂盒及检测方法，是以根据VNNV基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。利用该两对引物，可以特异性地扩增携带VNNV病毒的待测样品的有关基因片段，所建立优化的RT-PCR反应体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。因此使用本专利技术的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏而特异地检测感染VNNV的石斑鱼，大大高于传统和常规的生物学方法，可运用于石斑鱼各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。实施例1石斑鱼病毒性神经坏死病毒的基因诊断试剂盒1.RNA提取液(A液)，2管，5ml/管，内装Trizol液。2.B液，自备，主要为氯仿，200μl/份×10份，共2ml。3.C液，自备，主要为异戊醇，500μl/份×10份，共5ml。4.D液，自备，主要为70％乙醇，1ml/份×10份，共10ml。5.E液，1管，0.5ml/管，内装DEPC水。6.RT反应液(F液)，1管，0.1ml/管，内装RT反应液(10μl体系)，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H2O、随机引物、RNA酶抑制剂RNAsin(RI)、反转录酶M-MLV(RT)。7.RT-PCR反应液(G液)，1管，0.5ml/管，内装RT-PCR反应液(50μl体系)，包括10×Buffer(含mg2+)、dNTP、正向引物、反向引物、ddH2O和TaqE。8.阳性对照(H液)，1管，20ul/管，内装VNNV阳性模板。9.长方体盒子，8.5×5.8×6.2cm3。10.一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm，第二排五个孔，孔径1.0cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于长方体盒子中。该试剂盒中的内外一对引物的DNA序列如下F15’-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CTR15’-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GART反应液体系(10μl体系)如下5×Buffer 19μldNTP 1μlDEPC-H2O 3.3μl随机引物 1μlRNA酶抑制剂RNAsin(RI) 0.2μl反转录酶M-MLV(RT) 0.5μlRT-PCR反应液体系(50μl体系)如下10×Buffer(含mg2+) 10μldNTP 1μl正向引物F1 1μl反向引物R1 1μlddH2O 34.7μlTaqE 0.3μl实施例2石斑鱼病毒性神经坏死病毒的检测方法使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行1.取样品0.1g加1mlA液稀释，于匀浆器中冰浴匀浆，室温静置3～5min。2.在上述匀浆液中加入200μlB液，上下颠倒混匀，静置5min。3.4℃，12000r/min离心15min。4.取400μl上清，加入到500μlC液中，轻轻晃动，静置10min。5.4℃，12000r/min离心15min。6.弃上清，用1ml预冷的D液洗涤2次，4℃，7500r/min离心5min。7.空气干燥或在超净工作台上吹干，加50μl E液水溶解(若不能完全溶解可于55-60℃放置10min)。得到的RNA提取液可于-20℃保存。8.将RNA提取液在95℃预热5min。9.取2μl预热的RNA提取液，加入到F液中，37℃孵育1h。然后95℃水浴5min使失活，得到RT-PCR反应模板。10.分别取2μl模板和H液加入到G液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上。11.按下列条件扩增95℃ 10min本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种石斑鱼病毒性神经坏死病毒的基因诊断试剂盒，其特征是该试剂盒包括下列部件：１）．ＲＮＡ提取液Ａ液，２管，内装Ｔｒｉｚｏｌ液；２）．Ｂ液，１管，内装氯仿；３）．Ｃ液，１管，内装异戊醇；４）．Ｄ液，１管，内装７０％乙醇；５ ）．Ｅ液，１管，内装ＤＥＰＣ水；６）．ＲＴ反应液Ｆ液，１管，内装ＲＴ反应液，包括５×Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ、ＤＥＰＣ－Ｈ↓［２］Ｏ、随机引物、ＲＮＡ酶抑制剂ＲＮＡｓｉｎ ＲＩ、反转录酶Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ；７）．ＲＴ－ＰＣＲ反应液Ｇ液， １管，内装ＲＴ－ＰＣＲ反应液，包括含ｍｇ↑［２＋］的１０×Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ、正向引物Ｆ１、反向引物Ｒ１、ｄｄＨ↓［２］Ｏ和ＴａｑＥ。Ｆ１为：５’－ＣＧＴ ＧＴＣ ＡＧＴ ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＣＧ ＣＴ，Ｒ１为：５’－ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＡＣＧ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＡ；８）．阳性对照Ｈ液，１管，内装ＶＮＮＶ阳性模板；９）．盒子；１０）．一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何建国，黄剑南，黄志坚，邓敏，吕玲，陈晓艳，翁少萍，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]