用于诊断地中海贫血的DNA芯片制造技术

本发明专利技术涉及用于诊断地中海贫血的ＤＮＡ芯片及其制备方法，提供一种用于临床诊断α－型和β－型地贫的ＤＮＡ芯片，芯片由一基底和固定于基底上的探针组成，根据迄今已知的α－和β－球蛋白突变基因的序列，根据ＤＮＡ序列特异性识别的原理设计的诊断这些突变的ＤＮＡ探针。本发明专利技术的用于地中海贫血疾病诊断的ＤＮＡ芯片，可提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短诊断时间。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于诊断地中海贫血的DNA芯片，具体地说涉及用于诊断α-型和β-型地中海贫血的DNA芯片。本专利技术还涉及诊断地中海贫血的DNA芯片的制备方法。本专利技术还涉及用于扩增待检样品中DNA的PCR引物；本专利技术还涉及用于诊断地中海贫血的试剂盒以及检测待检样品中是否存在地中海贫血的相关基因的方法。
技术介绍
地中海贫血(也称地贫)是一种常见的遗传性疾病，世界各地都有发作，最多见于西自地中海区域，中经土耳其、中东各国，东至东南亚和我国南部。在我国β-型地中海贫血最多见于西南和华南一带，包括云南、贵州、四川、广西、广东、海南各省区，在苗、瑶、黎、壮等少数民族中尤为多见，其次为长江以南各地，北方很少见。据全国血红蛋白病协作组调查，β-型地中海贫血发生率为0.67％。α-型地中海贫血在我国高发于西南及华南一带，全国协作组调查国内α-地中海贫血发生率为2.93％，是我国南方最常见、危害最为严重地遗传病种之一。地中海贫血症的临床表型多样，可以从正常到需要反复输血，甚至危及生命，导致患者在未成年前夭折甚至死胎。由于该病在我国南方的高发病率，对社会和家庭产生巨大的精神和经济压力。然而目前尚缺乏有效的治疗措施，因此做好遗传咨询和产前诊断，阻止该类病重症患儿的出生，对有效监控此类疾病，提高人口素质有重要意义。由于地中海贫血的临床症状具有较大的变异性，轻型患者及携带者的检测易出现漏检。随着地中海贫血症分子遗传学研究的进展，使基因诊断成为可能。其中α-地中海贫血的基因缺陷主要为缺失型突变，当α-球蛋白链基因中的1条或多条丧失功能时就会引发α-型地中海贫血症，在中国地区普遍发生的3种α-地中海贫血症分别是由α基因上-α3.7，-α4.2和-SEA的片段缺失引起的。β-地中海贫血的基因只有一对，基因缺陷绝大多数属于非缺失型，即由于基因点突变造成β-球蛋白合成异常。β-地中海贫血症具有种族特异性，表现为许多突变仅发生在某个别种族中，而且几乎每一种族都具有几种常见的突变。到1998年，在中国β-地中海贫血群体中已发现23种不同的突变类型(见表1)。其中5种突变在中国人群中表现出较高的发病频率，约占总发生率的90％以上。大陆各省份共发现22种(其中3种仅见于少数民族)，台湾共发现18种(其中4种仅现于台湾)。α-地中海贫血症的传统基因诊断技术主要采用Southern印迹杂交方法，技术准确可靠，但操作繁琐，而且依赖用同位素，难以大面积推广。另外还有PCR扩增技术，这种方法简单快速，但容易出现假阳性。β-地中海贫血症常用诊断技术有反向点杂交(RDB)、PCR-SSCP、PCR-异源双链分析、PCR-DGGE、PCR-ARMS、PCR-ASO、PCR-RFLP以及PCR-错配化学裂解等技术。DNA芯片技术适用于基因缺陷的检测，一个芯片能同时容纳许多个探针，和PCR扩增技术结合，具有技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低的特点。DNA芯片技术是一种高度集成的DNA检测技术。首先采用专用自动化设备将已知DNA寡核苷酸探针排列在玻片或硅片上，然后将待检测样本中的所有DNA成分与芯片探针杂交，有相对应的靶DNA就会出现相应的杂交信号。理论上就可以做到一次实验检测多个基因。DNA芯片技术的设想可以追溯到90年代初，美国Affymetrix公司首先开始这方面的研究(http//www.affymetrix.com)。由于这项技术的广泛的应用前景以及巨大的经济效益，目前美国的斯坦福大学、美国橡树岭国家实验室、德国的自动化公司(http//www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/～autom)、Incyte商业公司和Hyseq公司都在进行全力研究，竞争市场份额。国内也有单位开始跟进了DNA芯片的研究。由于该技术需要高精度的DNA探针点样设备或光刻合成设备和专用的激光扫描检测装置，尚未普及应用。临床上，遗传病诊断与检测、细菌及病毒的检测、白细胞配型是DNA芯片应用的最具潜力的方面。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于临床诊断α-型和β-型地贫的DNA芯片，其利用现有的激光扫描仪，可以用于地中海贫血疾病的诊断并可提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短诊断时间。本专利技术的另一目的在于提供诊断地中海贫血的DNA芯片的制备方法；本专利技术的再一目的是提供用于扩增待检样品中DNA的PCR引物；本专利技术的又一目的是提供用于诊断地中海贫血的试剂盒以及检测待检样品中是否存在地中海贫血相关基因的方法。根据本专利技术的一方面，用于诊断α-型和β-型地贫的DNA芯片由一基底和固定于基底上的探针组成，用于该DNA芯片的基底可以是任何适于固定DNA探针的载体，例如，市售的EMS Electronic Microscopy Science CompanyLtd.生产的聚-L-赖氨酸包被并硅烷化的显微镜玻片，固定于基底上的探针则根据迄今已知的α-和β-球蛋白突变基因的序列，根据DNA序列特异性识别的原理设计的诊断这些突变的DNA探针。通过点样装置将探针按照一定规律排列在载体玻片或硅片上，经过固定和相关处理后就制成了DNA芯片。本专利技术的DNA芯片上可以仅包含针对α-球蛋白缺失基因设计的用于检测α-型地贫的DNA探针，或仅包含针对β-球蛋白突变基因设计的用于检测β-型地贫的DNA探针，也可以同时包含检测α-型和β-型地贫的DNA探针。根据本专利技术的另一方面，提供一种用于诊断地贫的DNA芯片的制备方法，该方法包括合成探针、将合成的探针及相应的对照组DNA按一定的顺序点样并排列于基底上、将点样后的探针DNA固定于基底上而制备得到DNA芯片。为了使DNA探针能有效地固定在玻片上，通常采用两种方法，第一种，在DNA探针合成后进行DNA探针5’末端活性基团的标记，这些活性基团有氨基、硫基等，固定DNA的玻片也需要进行活化处理，使之表面带有醛基或氨基，可以与DNA探针形成共价键。在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用消毒双蒸水稀释至200pmol/ul和等量1.0M1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC)和1.0MN-Hydroxysuccinimide(NHS)混合，进行点样。第二种，将DNA探针与点样缓冲液混合，用玻片点样机点在玻片上，80℃加热1到4小时，使用UVStratalinker 2400紫外交联仪在60mJ/cm2强度下进行紫外交联，然后用终止液终止反应。根据本专利技术的再一方面，提供用于扩增待检样品中DNA的PCR引物，该引物根据α-型和β-型地贫症基因突变的序列资料设计，其中α-型地贫的引物包括4对引物，检测β-型地贫的引物包括2对引物。在对待检样品进行PCR扩增后，为进行荧光标记，本专利技术进一步设计了延伸引物，延伸引物的Tm值为50-65℃，3’端与突变位点相邻。与β-地中海贫血症基因的20种点突变类型及α-地中海贫血症3种缺失突变类型相对应设计了20条和4条引物。根据本专利技术的又一方面，提供了用于检测地中海贫血症的试剂盒，其中包含用于诊断地中海贫血的本专利技术的DAN芯片以及用于扩增待检样品中DNA的本专利技术的PCR引物。本专利技术同时还提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诊断地中海贫血的ＤＮＡ芯片，包括 一基底；以及 固定于所述基底上的探针；其特征在于 所述探针为针对α－和／或β－球蛋白缺失或突变基因的特异性探针。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨梦苏，
申请(专利权)人：亚能生物技术深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]