中国汉族人基质金属蛋白酶-9基因重构、表达、纯化及其医学应用制造技术

本发明专利技术涉及一种中国汉族人ＭＭＰ－９基因的克隆、重组、表达、纯化方法与专用引物，以及ＭＭＰ－９蛋白及其类似物、衍生物在肝癌临床诊断和治疗方面的应用。本方法将获得的中国汉族人肝细胞ｃＤＮＡ，用ＰＣＲ方法（引物１为５′ＣＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴ引物２为５′ＧＡＣＧＧＧＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＣＴＣＡＧ）获得人ＭＭＰ－９基因，并将该基因重组后克隆到大肠杆菌表达载体中，诱导表达后提取ＭＭＰ－９及其衍生物ＰＭＭＰ－９，进而应用离子交换柱层析和凝胶过滤纯化出ＭＭＰ－９及其衍生物ＰＭＭＰ－９，为临床进一步观察肿瘤病人体内ＭＭＰ－９水平的变化，奠定了物质基础。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种表达纯化中国汉族人ＭＭＰ－９ｃＤＮＡ基因和重组ＰＭＭＰ－９的方法，其特征在于：包括以下步骤：（１）、克隆中国汉族人ＭＭＰ－９的基因，用反转录ＰＣＲ法扩增ＭＭＰ－９的基因；（２）、将上述扩增的ＭＭＰ－９基因与克隆载体连接，构建人Ｍ ＭＰ－９克隆质粒；（３）、将上述人ＭＭＰ－９克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒ＤＮＡ转染大肠杆菌；（４）、表达中国汉族人ＭＭＰ－９ａ、将上述带有中国汉族人ＭＭＰ－９基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的ＬＢ培养基板，将板 放置３７℃温箱过夜培养；ｂ、从板上选一个菌落，放入装ＬＢ培养基培养瓶内，在３０℃摇箱内培养，测菌液Ａ６５０ＯＤ值为１．０时停止培养；ｃ、向菌液内加ＩＰＴＧ，使其终浓度为０．５ｍＭ，继续培养６－８小时；ｄ、收获细菌；（５）、纯 化人ＭＭＰ－９ａ、将上述细菌沉淀用ｐＨ８．０的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用ｐＨ８．０的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；ｂ、裂解细菌，离心取上清液；ｃ、初步纯化人ＭＭＰ－９；ｄ、用离子交换和凝胶过滤层析进行纯化。（６）、重组中国 汉族人ＰＭＭＰ－９基因的构建ａ、以ＭＭＰ－９质粒ＤＮＡ为模板以新引物作ＰＣＲ扩增得到ＭＭＰ－９的衍生物ＰＭＭＰ－９；ｂ、将ＰＣＲ产物ＰＭＭＰ－９克隆到克隆载体质粒上；ｃ、经酶切将ＰＭＭＰ－９基因亚克隆到表达载体；（７）、重组 中国汉族人ＰＭＭＰ－９蛋白的表达和纯化ａ、将上述带有重组中国汉族人ＰＭＭＰ－９基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的ＬＢ培养基板，将板放置３７℃温箱过夜培养；ｂ、从板上选一个菌落，放入装ＬＢ培养基培养瓶内，在３０℃摇箱内培养，测菌液 Ａ６５０ＯＤ值为１．０时停止培养；ｃ、向菌液内加ＩＰＴＧ，使其终浓度为０．５ｍＭ，继续培养６－８小时；ｄ、收获细菌；ｅ、将上述细菌沉淀用ｐＨ８．０的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用ｐＨ８．０的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；ｆ、裂解细 菌，离心取上清液；ｇ、初步纯化重组人ＰＭＭＰ－９；ｈ、用离子交换和Ｎｉ－ＮＴＧ－Ｈｉｓ柱亲和层析进行纯化。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡敬群，杨建国，
申请(专利权)人：赵平，胡敬群，蔡建强，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]