核酸扩增检测方法技术

核酸扩增检测方法，包括向检测样品中加入至少一种线状探针和至少一种环状探针，二者的摩尔浓度比在１∶１００至１００∶１的范围内；其中，线状探针至少包含：（１）５’端与靶核酸配对的序列；（２）３’端与环状探针配对的短序列；环状探针至少包含：（１）与靶核酸配对的序列；（２）与线状探针３’端配对的序列；（３）用于调节环状探针总长度的填充序列。本发明专利技术方法可在同一反应管内，只用一种ＤＮＡ聚合酶，通过一步恒温反应完成核酸杂交、扩增、检测等多项操作，可在约一小时内将ＤＮＡ量扩增１０＃＋［１０］倍以上，检测灵敏度达到单拷贝水平，没有产物交叉污染，适用于检测ＲＮＡ和ＤＮＡ。可用来检测各种生物样品中是否有指定的核酸序列存在及定量地测出其浓度。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及核酸检测领域，更具体地说，涉及一种在体外通过核酸杂交和恒温扩增来特异性检测样品中的靶核酸是否存在及确定其浓度的方法。特异性核酸扩增的方法有若干种，可根据其是否需要温度循环分为两类。一类需要温度循环，如多聚酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)、连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)；另一类不需要温度循环而在恒温下进行扩增，如依赖转录的复制系统(transcription-based amplification system，TAS)、核酸序列自主复制系统(self-sustained sequence replication，3SR)、Qβ复制酶系统等。这些方法虽然都能将核酸进行高倍扩增，但在实际临床检测上都存在各自的缺点和局限性，诸如定量性差、复合度(multiplicity)低、易发生产物交叉污染、只适用于检测DNA或RNA中的一种，或需多种酶、多步操作等；而且温度循环方法与恒温方法相比有一个明显缺点在于需要使用特殊、昂贵的温度循环仪器。上述各种原因影响了这些方法在临床上的应用和推广。于是，如何找到一种能克服上述缺陷的、更为理想的体外核酸扩增和检测的方法就成为迫切需要解决的问题。目前有一种新的、很有发展前途的核酸扩增方法称为滚环扩增法(Rolling-circle amplification，RCA)。滚环扩增是一种在恒温条件下、利用DNA聚合酶和单链环状DNA模板，将与环状模板杂交的引物以线性方式连续不断延伸的DNA扩增方式。这种扩增又被称为线性滚环扩增(LRCA)，其扩增产物是一条极长的由环状模板互补序列拷贝串联成的单链DNA(Fire and Xu，1995，PNAS美国科学院学报924641-45；Liu et al.1996 J.Am.Chem.Soc.美国化学社刊1181587-94)。当有两种引物存在，其中一种引物与环状模板上一段序列互补，第二种引物与环状模板的另一片段序列相同时，可引起自发、连续的双向多重分支状链取代反应，称为超分支滚环扩增(Hyperbranched Rolling-circle amplifoication，HRCA)。HRCA呈指数(级数)方式连续扩增DNA，可在一个多小时内扩增109-12倍，扩增速度超过多聚酶链反应(PCR)。最终扩增产物是长度以环状模板为单位呈整数倍第增的双链DNA(Lizardi et al.1998 Nature Genet.自然遗传学杂志19225-32)。由于RCA反应具有简单、灵敏、定量、复合度高、无产物交叉污染等优点，因而在分子检测领域极有发展前途。然而在目前阶段，RCA在体外核酸检测中的应用还比较有限，主要用于原位信号放大和使用开环探针探测单核酸多样性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)。在用于原位信号放大时，一般先用一线状核酸探针的一端与附着在固相载体上的靶核酸形成稳定杂交，然后将未杂交的探针洗去，加入环状DNA模板，与线状探针的另一端形成稳定杂交，引发线性滚环扩增；扩增后的单链DNA产物再与带有标记的探针杂交，直接或间接地检测扩增信号。该方法的不足之处在于1)只使用一个识别靶核酸的探针，因而特异性不高；2)需要多步操作，比较繁琐；3)洗涤不彻底会造成较高本底。由此可见，需要有更加新颖、完善的设计来克服现有方法的缺陷，充分发挥滚环扩增原理的优势，扩大其在核酸检测中的应用范围。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述存在的问题，提供一种只使用一种酶、在同一反应管内、只须通过一步恒温反应便能使样品溶液中的靶核酸(包括DNA和RNA)迅速地扩增，从而可以在很短时间内利用仪器较精确地测出该靶核酸的浓度的方法。本专利技术的另一个目的是提供一个用于实现上述方法的专用试剂盒。本专利技术人为了实现上述目的而进行了深入研究，结果发现，在上述现有滚环扩增技术的基础上，把只使用一种探针与靶核酸杂交、冲洗后再进行扩增的步骤改变为同时使用一种线状探针和一种环状探针与靶核酸片段杂交并将二探针的浓度比限定在一定的范围内，同时限定二者相互间具有一定长度的配对序列，即可达到上述目的，至此便完成了本专利技术。也就是说，本专利技术的技术方案如下1.一种，该方法包括向被检测样品中加入核酸探针及其他公知的必要辅助成分，在设定温度下进行扩增反应，在反应进行中或完成后用仪器检测扩增信号并定量分析靶核酸，据分析结果判断样品中是否存在靶核酸并确定其浓度，其特征在于，上述的核酸探针是至少包括一种线状探针和一种环状探针的探针组，其中，线状探针与环状探针的摩尔浓度比在1∶100至100∶1的范围内；其中，线状探针至少包含如下两个部分(1)5’端与靶核酸配对的序列，其长度在15-35个核苷酸的范围内；(2)3’端与环状探针配对的短序列，其长度在2-10个核苷酸的范围内；并且上述(1)和(2)两部分之间的间隔在0-5个核苷酸的范围内。环状探针的总长度在35-200个核苷酸的范围内，其中至少包含如下3个部分(1)与靶核酸配对的序列，其长度在15-35个核苷酸的范围内；(2)与线状探针3’端配对的序列，其长度在2-10个核苷酸的范围内；(3)用于调节环状探针总长度的填充序列；并且上述(1)和(2)两部分之间的间隔在0-5个核苷酸的范围内。2.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说线状探针与环状探针的摩尔浓度比在1∶10-10∶1的范围内。3.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说线状探针5’端与靶核酸配对的序列的长度在18-32个核苷酸的范围内。4.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说环状探针中与靶核酸配对的序列的长度在18-32个核苷酸的范围内。5.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说线状探针可呈下列3种状态中的任一种(a)自由态；(b)附着于载体上；(c)部分呈自由态，部分附着于载体上；组成上还可包括任何修饰的核苷酸或其它成分。6.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说探针组中还包括至少一种线状扩增引物，其长度在15-35个核苷酸的范围内；其序列的全部或部分与环状探针填充序列中一片段相同。7.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说扩增反应成分中包括DNA产物检测试剂。8.如技术方案1所述的方法，其特征在于，其中所说用仪器检测核酸扩增信号的方法可以是检测单链或双链DNA使用的任何方法。9.如技术方案1-8中的任一项所述的方法，其特征在于，整个核酸扩增检测过程在同一反应容器中进行。10.一种专用试剂盒，用于实施技术方案1-9中的任一项所述的方法，其特征在于，其中装有用于检测样品中可能存在的靶核酸种类及相对数量所需的试剂。下面对本专利技术进行详细描述。本专利技术所提出的方法的作用机理大致如下当线状探针和环状探针与靶核酸杂交后，线状探针的3’端作引物以环状探针为模板，在DNA多聚酶催化下进行线性滚环扩增；反应溶液中的链取代扩增引物不断跟滚环扩增产生的单链DNA产物杂交并以其为模板，以链取代反应的方式进行二级扩增，连续产生不同长度的单链DNA；这些二级单链DNA产物的3’端与溶液中自由的线状探针杂交并合成最终的双链DNA产物；在此过程中，靶核酸不断地跟前一组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸扩增检测方法，该方法包括：向被检测样品中加入核酸探针及其他公知的必要辅助成分，在设定温度下进行扩增反应，在反应进行中或完成后用仪器检测扩增信号并定量分析靶核酸，据分析结果判断样品中是否存在靶核酸并确定其浓度，其特征在于，上述的核 酸探针是至少包括一种线状探针和一种环状探针的探针组，其中，线状探针与环状探针的摩尔浓度比在１∶１００至１００∶１的范围内；其中，线状探针至少包含如下两个部分：（１）５’端与靶核酸配对的序列，其长度在１５－３５个核苷酸的范围内；（２）３’ 端与环状探针配对的短序列，其长度在２－１０个核苷酸的范围内；并且上述（１）和（２）两部分之间的间隔在０－５个核苷酸的范围内；环状探针的总长度在３５－２００个核苷酸的范围内，其中至少包含如下３个部分：（１）与靶核酸配对的序列，其长度在１５ －３５个核苷酸的范围内；（２）与线状探针３’端配对的序列，其长度在２－１０个核苷酸的范围内；（３）用于调节环状探针总长度的填充序列；并且上述（１）和（２）两部分之间的间隔在０－５个核苷酸的范围内。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田敬东，龚启洪，
申请(专利权)人：田敬东，龚启洪，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]