一种用于分析多核苷酸的方法技术

本发明专利技术涉及分析多核苷酸的方法，其中包括在不需要进行全部序列测定的情况下在核苷酸序列中检测差异、对一多核苷酸进行完整序列测定、对ＤＮＡ进行基因分型、在将一多核苷酸片段切割成片段的过程中对其进行标记。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要与有机化学、分析化学、生物化学、分子生物学、遗传学、诊断学及医学有关。尤其与分析多核苷酸的方法有关，即决定一多核苷酸的全部核苷酸序列，以检测相关多核苷酸之间的核苷酸序列差异，并用于DNA基因分型。与本专利技术相关的
技术介绍
以下内容仅作为背景资料，无意也不认为是本专利技术的在先技术。DNA是所有活的细胞中遗传信息的载体。一个生物体地遗传和物理特性，即其基因型和表现型，是由该生物体中DNA的精确核酸序列所控制的。存在于一个生物体的DNA中的所有序列信息的总和，称为该生物体的“基因组”。DNA分子的核酸序列含有由4种核苷酸组成的线性聚合体。4种核苷酸各自为三部分组成的分子，每一部分包含(1)4种杂环碱基中的一种，即腺嘌呤(简写为A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，和胸腺嘧啶(T)；(2)戊糖衍生物2-脱氧核糖，通过其1-碳原子与杂环碱基的环氮原子结合；(3)一个在磷酸分子和糖组分的5’-羟基基团之间形成的单磷酸单酯。核苷酸通过在一个核苷酸的5’-磷酸和另一核苷酸的3’-羟基基团间形成二酯而加以聚合，以形成DNA的单链。在自然状态下，这些单链中的两条链通过互补核苷酸之间的氢键发生相互作用，A与T互补，C与G互补，以形成“碱基对”，从而导致著名的Watson与Crick的DNA双螺旋的形成。RNA与DNA类似，例外的是，碱基胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)所取代，戊糖是核糖本身，而不是脱氧核糖。此外，RNA在自然状态下主要以单链存在，也就是说，两条链通常不结合形成双螺旋。当提到多核苷酸中的核苷酸序列时，习惯上使用碱基的缩写，即A、C、G、和T(或U)，以代表含有该碱基的整个核苷酸。例如，一个以“ACG”命名的多核苷酸序列，它的意思是，一个腺嘌呤核苷酸通过磷酸酯键与一胞嘧啶核苷酸连接，后者又通过另一磷酸酯键与一鸟嘌呤核苷酸连接。如果所描述的多核苷酸是DNA，则人们会认为，“A”代表含有脱氧核糖糖基的腺嘌呤核苷酸。如果有混淆的可能，则DNA分子中的“A”可写作“脱氧A(deoxyA)”或简单写作“dA”。由于T只存在于DNA而非RNA中，不会引起混淆，因此不用写作脱氧T或dT。作为一种粗略的估计，可以说，一个生物体中的基因数与该生物体表现型的复杂性——即复制该生物体并使其行使功能所需要的基因组产物的数目——成正比。人类基因组目前被认为是最复杂的基因组之一，该基因组含有大约6-10万个基因，约含33亿个碱基对。每一个基因为一个RNA编码，后者则大多数为一个特定蛋白质编码，该蛋白质行使特定的生化或结构功能。这些基因中的任一个在遗传编码上的差异(也称为多型性或突变)将导致生化活性发生改变或根本没有生化活性的蛋白质或RNA的产生。这可由含有一特殊基因的DNA中的单一核苷酸的微小变化，如添加、删除、或替换(转变或转换)所引起，该现象有时被称为“单核苷酸多型性”或“SNP”。遗传密码中带有此类突变，其结果可能无害，但也可能使人衰弱，甚至致命。目前，有超过6,700种人类疾病据信带有遗传成分。例如，血友病、阿尔茨海默氏症、亨廷顿氏症、Duchernne肌营养不良、及囊性纤维化已知都与包含特定基因的DNA中核苷酸序列的差异有关。此外，有越来越多的证据显示，某些DNA序列的变化可能使一个人偏向于发生某些异常情况，如肥胖、糖尿病、心血管疾病、中枢神经系统异常、自身免疫疾病以及癌症等。特定基因的DNA序列的差异已经显示与病人对，例如，药物、放射性治疗、营养状态、以及其他医学干涉上所观察到的不同反应有关。因此，检测一个生物体基因组中DNA序列差异的能力是探索差异性、医学病症与对医学干涉的反应三者关系中的一个重要内容。一旦建立起某种联系，在一个病人的基因组中检测差异性的能力就能够成为一个极其有用的诊断手段。甚至可能使用早期差异性诊断，在一种症状具有身体表现之前，对该症状进行诊断，有可能还进行治疗，甚至加以预防。此外，差异性诊断还可能成为一种有价值的研究手段，因为它可以导致对疾病的遗传基础的发现，这些疾病的原因或者不为人知，或者被认为是非遗传性的。当病人对所建议的一种或多种治疗方法的反应有所不同时，差异检测也有利于指导选择最佳治疗方法。尽管对遗传密码的差异性进行检测的好处十分明显，但在实际应用方面却存在困难在比较了50至100个个体后发现，据估计，人类DNA序列差异性的发生频率大约为每100个核苷酸中有一个。Nickerson，D.A.，《自然遗传学》(Nature Genetics)，1998，223-240。这相当于在人类基因组中有多达3千万个差异。并非所有的、事实上只有相当少量的差异能够对人类的身体健康带来可以测量到的影响。对这3,000万个差异进行检测、然后决定他们中的哪些与人类健康有关，这确实是一项相当艰巨的任务。除了差异性检测之外，对一个生物体基因组核苷酸序列的了解将对理解该生物体的整体生物学作出无法估量的贡献，也就是说，它将导致对每一基因产物、基因产物在该生物体基因组中的组织和排列、控制基因表达(即每一基因产物的产生)及基因复制所需要的序列的认识。事实上，对此类知识和认识的探求正是人类基因组计划存在的原因，该计划是一项国际化的努力，目标在于对整个人类基因组进行测序。不管是何种生物体，一旦获得单一基因组的序列，便有利于获得该种属其他生物体的部份或全部序列，尤其是种属内表现出不同特征的生物体，从而确定与不同特征相关的DNA序列的差异。对微生物来说，这些不同的特征可能包括，在坏的方面是致病性，而在好的方面则是制造一特殊的多聚体或改善污染的能力。生长速度、营养成分或抗病虫害的能力上的不同，这些都是可能在植物中间观察到的差异。即使在人类，对疾病敏感性的差异以及对一特殊治疗的反应上的不同都可能与遗传，即DNA序列上的差异性有关。由于DNA序列信息、尤其是确认同一种属不同个体之间的DNA序列的差异性具有非常广阔的用途，在未来对快速、廉价的DNA自动测序及差异检测方法的需求预计将迅猛增长。一旦一段DNA片段(如基因，cDNA，或在更大规模上的一个染色体或一整个基因组)序列被测定出来，则同一种属不同成员之间存在的该DNA片段的序列差异性就能够被加以研究。完整DNA测序便是完成这一工作的明确方法。因此，有可能确定从种属中不同成员身上获得的DNA片段拷贝的完整序列，而只需将这一完整序列与从前所得到的序列相比较。然而，目前所使用的DNA测序技术价格昂贵、耗时，并且为了获得高度准确性，DNA必须过量。大多数大的测序项目对每个核苷酸需要5-10倍的覆盖率，这样才能达到2,000至10,000个碱基中有1个错误这样可接受的错误率。此外，对于检测差异性来说，DNA测序是一种效率非常低的方法。例如，一个基因的两个拷贝之间的差异(例如当将两个染色体进行比较时)，其发生频率可能低至1000个或更多的碱基才发生一次。因此，序列中只有少部分是需要的，也就是说存在差异的。然而，如果使用全部测序，则需要测序庞大数量的核苷酸，才能获得所需要的与前面所说的那一小部分相关的信息。例如，假设我们需要比较一段3,000个核苷酸的DNA序列的10个不同版本，目的是为了检测它们中间的4处差异。即使我们让DNA过量两倍(取自每一个体的3,000个核苷酸的双链DNA片段中的每一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种切割多核苷酸的方法，包括： ａ．将一多核苷酸中事实上每一发生位点的一个或多个天然核苷酸用修饰核苷酸替代，以形成一修饰多核苷酸；条件为：当只有一个天然核苷酸被代替时，修饰核苷酸不是核糖核苷酸或核苷酸α－硫代三磷酸； ｂ．将所述的修饰多核苷酸与一试剂或多个试剂接触，这些试剂在所述的一个或多个修饰核苷酸的所述的实际上每一发生位点都对修饰多核苷酸进行切割。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：小温森特P斯坦顿，刘嘉，川手智彦，格利高利沃汀，
申请(专利权)人：瓦瑞詹尼克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]