一种重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因及其表达系统、表达产物、生产方法和应用技术方案

一种石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如序列表所示。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于基因工程
，涉及一种石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因及含有该基因的载体和重组工程菌株以及该基因所编码和表达的产物在制备海水鱼类使用的生长与繁殖调控剂中的应用。
技术介绍
脑垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activatingpolypeptide，简称PACAP)，是38个氨基酸组成的肽类物质。PACAP最初是从绵羊下丘脑抽提物中被发现的，它属于由血管活性肠肽(VIP)、胰高血糖素(glucagon)、生长激素释放因子和分泌素所组成的基因家族。目前，在鱼类中发现PACAP对鲤科鱼类脑垂体激素分泌活动的具有调节作用，并且证明下丘脑产生的PACAP能在脑垂体水平促进生长激素和促性腺激素的释放。但总体来说，鱼类PACAP的结构与功能、受体结合、基因克隆等方面的研究在国内外还处于起步阶段，虽然编码PACAP的基因在其他一些鱼类中已被克隆，但是对于重要的海洋经济鱼类石斑鱼的PACAP基因的克隆和鉴定则仍未见报道。近年来，了解PACAP生理作用机理，已成为鱼类生理研究的热点。由于PACAP在鱼体内含量极微，分离提纯相当困难，难以应用于生产。因此分离和鉴定PACAP基因，为下一步采用DNA重组技术将其克隆到原核或真核细胞中，可为得到大量廉价的重组PACAP奠定基础。石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类，属鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)，是一种名贵的海水鱼类，具有极高的经济价值。但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效地调控其生长与繁殖活动的调控剂。而石斑鱼PACAP则可以用于制备这类调控剂，因此采用DNA重组技术来获得大量的石斑鱼PACAP具有很好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组斜带石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因； 本专利技术的另一目的在于提供含有该基因的载体，特别是克隆载体和表达载体；本专利技术的另一目的在于提供上述载体转化的重组工程菌株；本专利技术的另一目的在于提供上述基因编码的并由上述重组工程菌株表达的重组斜带石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽；本专利技术的另一目的在于提供重组斜带石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽的生产方法；本专利技术的另一目的在于提供上述重组多肽在制备海水鱼类使用的生长与繁殖调控剂中的应用。本专利技术提供的石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因，是以斜带石斑鱼脑组织总RNA为模板，采用RT-PCR和RACE方法而得到的来源于石斑鱼的腺苷酸环化酶激活多肽的成熟肽的结构域所对应的基因片段，其核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如序列表所示。本专利技术还构建了含有上述石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因的载体，优选的是含有该基因的大肠杆菌表达载体。该载体的构建是按照常规方法，将通过PCR方法扩增合成的石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因经酶切和分离纯化后，接入到已有载体的相应酶切位点之间，即构建成所需的含有石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因的表达载体。上述的含有石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因的大肠杆菌表达载体优选的是由本专利技术提供的石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因与大肠杆菌载体表达载体pTRX构建而成的重组表达载体，命名pTRX-PACAP。本专利技术还用上述含有石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因的相应载体进一步构建了高效表达重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽的大肠杆菌重组工程菌株。本专利技术的能表达重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽的大肠杆菌重组工程菌株，优选的是由含有石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因的表达载体pTRX-PACAP转化大肠杆菌BL21而得到，并命名为pTRX-PACAP-BL21。本专利技术提供了利用该大肠杆菌重组工程菌株生产石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽的方法。先将菌株进行发酵并经IPTG诱导使其高效表达石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽重组蛋白，再收集菌体经分离纯化得到重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽产品。利用该大肠杆菌重组菌株pTRX-PACAP-BL21生产石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽的具体步骤为(1)菌种的培养发酵和诱导表达将菌种接种在含氨苄青霉素的LB丰富液体培养基中，37℃，150-200转/分培养过夜，次日以1∶50转种于相同培养基中，37℃，150-200转/分培养至OD600为0.5，加IPTG至终浓度为0.5mol/L，；25℃继续振荡培养13小时后收菌。(2)表达产物的纯化收集上述纯化的菌体，将细胞破碎后离心收集包含体沉淀，菌体超声裂解液进行Ni-Chelsting亲和层析，Sephadex G-25凝胶过滤脱盐、去咪唑，DEAE Sepharose阴离子交换柱浓缩并去除碱性杂蛋白，Sephadex G-25凝胶过滤脱盐，25℃肠激酶切割PACAP-PTRX融合蛋白。DEAE Sepharose阴离子交换层析出去残余酸性杂蛋白，PACAP-PTRX成熟蛋白经Sephadex G-25分子筛更换PB缓冲系统，SP Sepharose阳离子交换柱浓缩并出去杂蛋白，经冻干即为纯化的重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽。上述重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽可以直接用于制备适合海水鱼类尤其是石斑鱼属使用的生长与繁殖调控剂，也可以通过适当的赋型剂、保护剂按一定比例形成组合物来应用。本专利技术提供的石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽基因通过与适当的载体连接后可在相应的微生物菌株中高效表达，分离纯化后即可得高纯度的重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽，而且具有表达水平高，容易纯化的优点。所以通过本专利技术，可以方便地大量生产重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽，成本较低。这种来源稳定、成本便宜的重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽可进一步应用于制备适合海水鱼类尤其是石斑鱼属使用的生长与繁殖调控剂。附图说明图1是通过PCR扩增得到石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)cDNA的凝胶电泳分析图。其中1.100bp DNA相对分子质量标准；2.第一轮PCR产物；3.嵌套PCR产物。图2是3’RACE的结果。其中1.100bp DNA相对分子质量标准；2.第一轮PCR产物；3.嵌套PCR产物。图3是5’RACE的结果。其中1.100bp DNA相对分子质量标准；2.加尾反应20分钟产物；3.加尾反应5分钟产物。图4是重组表达载体PACAP-PTRX的构建过程示意图。图5是重组石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳图谱。其中1.蛋白质相对分子质量标准；2.BL21不诱导；3.pTRX不诱导；4.pTRX-PACAP-BL21诱导。具体实施例实施例1石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽的cDNA的合成根据已知的哺乳动物和石斑鱼的石斑鱼腺苷酸环化酶激活多肽cDNA序列，设计三条引物senseP15’GCA(GT)G(AG)C(AC)A(AGT)(AG)TCTA GTA(AG)AG C(GT) ACT 3’senseP25’GA(AG)A(AG)GA(AG)C(GC)GAAA(GC)GCATGCAG3’antisenseP35’TA(AGC)(AGC)C(ACT)A(AG)(GCT)CG(AGC)CGTCCTTTG3’senseP1、antisenseP3为合成PACAP 524 bp引物，senseP2、antisenseP3为合成PACAP编码区288bp cDNA的引物。以脑总RNA的反转录产物cD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：李文笙，江涌，林浩然，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：