荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列及试剂盒制造技术

一种荧光ＰＣＲ定量检测含有Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）基因转基因玉米探针序列及试剂盒，所述的探针序列包括：序列ｃｃｇｃｃｇｃｇａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａｃｃｇｔｇ向上游位移５个碱基、向下游位移５个碱基的区域内形成的探针序列。试剂盒包括：核酸提取试剂，核酸扩增试剂，定量标准品，其中，核酸扩增试剂包括：ＣｒｙＰＣＲ反应液、ＺｅｉｎＰＣＲ反应液、Ｔａｑ酶、ＵＮＧ等，标准品包括Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）不同浓度的阳性品以及阴性对照品。本发明专利技术的优点是对转基因作物检测灵敏度可达０．１％，具有良好的灵敏度和特异性。定量偏差为５％－２０％，检测效率已达核酸扩增检测领域里的该项目的国际水平。采用了植物内源基因Ｚｅｉｎ作为内标，避免核酸提取造成的误差及假阴性的产生。实行了实时监测，大大节省检测时间，节约人力物力。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列及试剂盒。
技术介绍
据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001年全世界转基因作物种植面积为5260万公顷，十多个国家已种植转基因作物，其中99％的转基因作物种植在美国、阿根廷、加拿大和中国，已批准商品化转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等，已批准商业化种植的已近90种。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。对转基因产品的安全性，特别是转基因食品对人和动物的健康及对生态环境的影响，自转基因技术出现以来，就一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点问题，2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定，其中最重要的措施之一就是对转基因产品要进行检验，以明确其种类，确定是否为已批准的或已获得许可的转基因产品，以防止一些具有风险的转基因产品任意扩散，造成不可挽回的损失。2001年欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超过1％的转基因产品(阈值)则不用标识，这样转基因产品检测不但需要定性，还需要定量检测。不同国家阈值大小不一样，从1-5％不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，并于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法。目前全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律法规。总之，转基因产品的研究、生产、销售都要在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点进行。虽然联合国所属机构(FAO、WHO等)及一些地区性国际组织在召集建立世界统一的检测技术和方法标准，但由于对于转基因产品的安全性、风险管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各国尚难达成一致的意见。综合世界各国转基因产品的检测技术，根据检测目标主要分成下面三个类型检测插入的外源基因，检测外源基因表达物(RNA或蛋白质)，检测插入外源基因对受体生物基因表达的影响(主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对整个代谢产物的影响)。由于第三类型的检测成本高、所需时间长，并且被认为重要性较低，目前对这方面的检测在实际工作中较少涉及。在前两种类型的检测工作中所涉及的检测目标包括三种类型DNA、RNA和蛋白质。对于蛋白质的检测主要用血清学方法，由于有些转基因产品不表达蛋白质或表达量不稳定，血清学检测方法仅在个别转基因产品检测中应用。对于DNA和RNA的检测主要采用PCR及直接核酸杂交等基因诊断技术。基因扩增诊断方法到目前为止已经历了以下几个方面的发展PCR/电泳检测、传统杂交或测序；PCR-ELISA；实时荧光PCR。在目前已商品化的多种转基因玉米中，有四种(Bt-176，Bt-11，MON810和MON80100)含有插入的来源于苏云金杆菌(Bt)且具有抗虫活性的Cry1Ab外源基因序列和玉米内源基因zein序列，可作为检测的靶序列。Cry1Ab基因的其他写法如cryIA(b)等含义相同，它是一个人工合成的截短了的抗虫基因，来源于苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki strain HD-1)。含有Cry1Ab基因的转基因作物具有抗虫特性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是要提供一种荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列及试剂盒。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米探针序列包括序列ccgccgcgagctgaccctgaccgtg向上游位移5个碱基、向下游位移5个碱基的区域内形成的序列。试剂盒组成核酸提取试剂核酸扩增试剂Cry PCR反应液(定量)Zein PCR反应液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)定量标准品Cry-STND1(2.0％)Cry-STND2(0.5％)Cry-STND3(0.1％)Cry定量阴性对照全基因序列见附录一核酸提取试剂可使用传统的植物DNA提取方法的试剂，例如CTAB法，也可采用Promega公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food试剂盒(Cat FF3750，200 tests)。本试剂盒采用PCR方法结合荧光探针的扩增双检测技术，在同一试管中以Fam和Tet两种荧光通道信号分别追踪Cry1Ab基因序列和内源基因zein序列的扩增动力学变化，为消除DNA样品上样量的差异，以ΔCt值(Fam-Ct值与Tet-Ct值之差)对梯度GMO含量的标准品做标准曲线，由标准曲线获得待测玉米样本的GMO含量。附图说明图1荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米的扩增图(目的基因Cry1Ab)图2荧光PCR定量检测含有Cry1A(b)基因转基因玉米的扩增图(内标基因Zein)图1中，阳性样品为0.1％，0.5％，1.0％，2.0％，5.0％，Fluka玉米标准品，待测样品1，待测样品2，阴性样品为0％Fluka玉米标准品和阴性玉米。图1中，1为0.5％，2，3为0.1％，4为0％。图2中，5为0.5％，6为0.1％，7为0.1％，8为0％具体实施方式靶区域的选择以及引物和探针的设计本试剂盒选择转基因玉米的转入基因片段作为外源检测的靶片段，以玉米内源基因zein作为检测监控的参照基因。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。Cry1A(b)的引物和探针名称(5′-3′方向)区域1探针165，176，266，282，366，422上游引物Cy-2F下游引物Cy-2R，410r，485r区域2探针633，647，703上游引物576，590，626，648，657，677下游引物689，734，741，752，807，829区域3探针851上游引物792下游引物1015，1078Zein片段的引物和探针名称(5′-3′方向)区域1探针183上游引物63，77，110，131，下游引物218，228，313，328，348区域2探针352上游引物197，206，215，220，252下游引物403，406，422，505单检反应体系的建立及优化反应体系的建立和优化中所采用的靶区域阳性模板以如下方法获得用含有靶序列的转基因玉米2％标准品100mg(粉末)按Promega Kit方法提取DNA，以最末端的两对引物扩增PCR产物(35cycles)稀释10000倍作为引物与探针初筛的模板，以2％标准品原液作为再次筛选的模板。引物和探针的筛选引物筛选实验中将上述上游引物和下游引物任意配对，在PE7700上进行实验。扩增反应体系配置根据以往引物筛选经验，引物筛选所采用的PCR反应体系如下表所示。PCR反应体系组分 终浓度10×PCR反应液 1×dNTP(含dUTP) 0.2mmol/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光ＰＣＲ定量检测含有Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）基因转基因玉米探针序列，其特征在于所述的探针序列包括：序列ｃｃｇｃｃｇｃｇａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａｃｃｇｔｇ向上游位移５个碱基、向下游位移５个碱基的区域内形成的探针序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文斯，朱水芳，黄茜华，
申请(专利权)人：深圳市匹基生物工程股份有限公司，国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]