方法技术

本发明专利技术涉及利用任何（或一种）单核苷酸多态性检测技术，优选利用等位基因特异性扩增技术如扩增受阻突变系统（ＡＲＭＳ）或优选利用等位基因选择性杂交探针技术如Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓ或ＴａｑＭａｎ，检测真菌中对应于酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）细胞色素ｂ残基１２９的位置的一个或多个细胞色素ｂ突变的诊断方法，该细胞色素ｂ突变引起了对嗜球果伞素类似物或相同的交叉抗药性组中化合物的抗药性。本发明专利技术也涉及用在本发明专利技术方法中的突变特异寡核苷酸，及含有这些寡核苷酸的诊断试剂盒。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术，优选利用等位基因特异性扩增技术如扩增不应突变系统(ARMS)或优选利用等位基因选择性杂交探针技术如Molecular Beacons或TaqMan，检测真菌中对应于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的一个或多个细胞色素b突变的诊断，该细胞色素b突变引起了对嗜球果伞素类似物或在相同的交叉抗药性组中的化合物的抗药性。本专利技术也涉及用在本专利技术中的突变特异寡核苷酸，及含有这些寡核苷酸的诊断试剂盒。
技术介绍
杀真菌剂在农业中的广泛应用是相对近代的现象，在过去40年期间发生了大部分重要进展。以前，农民常常忽视或没有认识到真菌病原体对他们农作物产量和质量的影响。然而，现今这些损失是不可接受的，农民依靠杀真菌化学药剂的应用控制真菌疾病。结果，商品化的杀真菌剂已经变成了整个农用化学品商业的重要部分，1996年全世界的销售约是59亿美元，相当于整个农用化学品市场的18.9％(WoodMackenzie，1997a‘Agchem products-The key agrochemical productgroups’，in Agrochemical Service，Update of the ProductsSection，1997年5月，1-74)。农民已经可以得到大量的杀真菌剂；最近版本的The Pesticide Manual(Tomlin，1994第10版，BritishCrop Protection Council，Farnham，UK，和the Royal Society ofChemistry，Cambridge，UK)包含目前使用的158种不同杀真菌活性组分。然而，目标是新化合物发现和开发的进一步工业研究是极其深入细致的，并且产品管理程序在确保具有特定作用方式和/或属于特定化合物系列的杀真菌剂的最好和最长持久效能方面极其重要。特别地，当引入具有新作用方式的杀真菌剂时，研究开发有效的抗药性处理策略至关重要(Fungicide Resistance ManagementInto The NextMillenium(Russell)1999，in Pesticide Outlook，1999年10月(213-215)。嗜球果伞素类似物组成了主要新系列的农业杀真菌剂，认为其是自从20世纪70年代1，2，4-三唑发现以来农业杀真菌剂史上最激动人心的发展。嗜球果伞素类似物的杀真菌活性是它们能抑制真菌中线粒体呼吸的结果。更具体地，已经证实这些化合物有新的单点作用方式，通过阻断泛醌醇(ubiquinol)细胞色素c氧化还原酶复合物(细胞色素bc1)发挥它们对真菌的作用，因此在真菌细胞中降低了高能ATP的产生(Becker等，1981 FEBs Letts.132329-33)。该族抑制剂阻止了多聚体细胞色素b蛋白质上泛醌氧化还原位点Qo的电子传递(Esposti等，1993 Biochim.et Biophys Acta 1143(3)243-271)。不同于许多线粒体蛋白质，细胞色素b蛋白质是线粒体编码的。文献报道表明在细胞色素b靶位点特定氨基酸的改变能影响嗜球果伞素类似物的活性。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(此后称为S.cerevisiae)(JP Rago等，1989 J.Biol.Chem.26414543-14548)，小鼠(Howell等，1988 J.Mol.Biol.203607-618)，Chlamydomonas reinhardtii(Bennoun等，1991 Genetics 127335-343)和红细菌(Rhodobacter spp)(Daldal等，1989 EMBOJ.8(13)3951-3961)中已经进行了深入的诱变研究。研究了在海胆Paracentrotus lividus(Esposti等，1990 FEBS 263245-247)和担子菌真菌Mycena galopoda和Strobilurus tenacellus(Kraiczy等，1996 Eur.J.Biochem.23554-63)(两者都产生了嗜球果伞素类似物的天然变异体)中对嗜球果伞素类似物抗药性的天然基础，从该研究中收集了相关信息。存在两个不同的细胞色素b基因区域，其中氨基酸改变对嗜球果伞素类似物的活性有显著的作用。这些区域包含氨基酸残基125-148和250-295(根据酿酒酵母(S.cerevisiae)残基编号系统)。更精确地，已经表明在残基126，129，132，133，137，142，143，147，148，256，275和295的氨基酸改变引起了对嗜球果伞素类似物的抗药性(Brasseur等，1996 Biochim.Biophys.Acta 127561-69和Esposti等，(1993)Biochimica etBiophysica Acta，1143243-271)。公开的国际专利申请号WO 00/66773描述了真菌细胞色素b基因中突变的鉴定，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基143位置引起了编码的蛋白质中甘氨酸到丙氨酸的置换(G143A)。本专利技术第一次鉴定了重要植物病原真菌田间分离物细胞色素b基因中其它突变的至关重要性，所述重要植物病原真菌显示了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中的化合物的抗药性。专利技术概述根据本专利技术第一方面，现在我们提供了检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变存在或缺乏的，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中的氨基酸置换，其中所述突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中的任何其它化合物的抗性，所述包括利用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术鉴定真菌核酸中所述突变的存在或缺乏。根据本专利技术第一方面的优选实施方式，现在我们提供了检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变存在或缺乏的，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换，其中所述突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性，所述包括利用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术鉴定真菌核酸中所述突变的存在或缺乏。在本专利技术中，现在我们专利技术了基于单核苷酸多态性检测，包括等位基因特异性扩增，检测真菌细胞色素b基因中一个或多个点突变的诊断。根据本专利技术，本领域技术人员知晓大量分析，所述分析可以用于检测在一个或多个多态位置变异核苷酸的存在或缺乏。一般地，等位基因变异的检测需要突变辩别技术，可选的扩增反应和可选的信号产生系统。Nollau等，Clin.Chem.431114-1120，1997和在标准教科书，例如‘Laboratory Protocols forMutation Detection’，U.Landegren编辑，Oxford University Press，1996及‘PCR’第二版，Newton和Graham，BIOS Scientific Publish本文档来自技高网...

【技术保护点】
真菌细胞色素ｂ基因中一个或多个突变的检测方法，该突变在对应于酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）细胞色素ｂ残基１２９的位置引起了编码蛋白质中氨基酸置换，其中所述突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗性组中任何其它化合物的抗性，所述方法包括利用任何（或一种）单核苷酸多态性检测技术鉴定真菌核酸中所述突变的存在或缺乏。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JM伯布里奇，SM克里尔，CP斯坦格，JD温达斯，
申请(专利权)人：辛根塔有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]