等位基因的测定方法技术

本发明专利技术提供分离和鉴定基因组ＤＮＡ样品中的等位基因，从而分离和鉴定单元型的方法和试剂盒。该方法通常涉及使对等位基因中的多态性位点特异的引物与该ＤＮＡ样品杂交，将引物延伸一个或多个核酸，分离延伸的引物，并且利用延伸的引物鉴定等位基因。该方法还可以进行两个引物的连接，它们的分离以及接着在鉴定目标等位基因中的应用。该方法中还可以使用另一种引物作为延伸第一引物的封闭位点，以便复制和鉴定包含多态性位点的ＤＮＡ片段。可以对延伸或没有延伸的引物进行标记，使得引物容易被分离和／或鉴定。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过鉴定基因中一个或多个异源序列位点而分离和鉴定等位基因的方法。更具体地，本专利技术涉及使用一个或多个引物分离和鉴定等位基因的方法。
技术介绍
个体之间序列差异最常见的形式是单核苷酸多态性，普遍公知为SNP。随着人体基因组计划的完成，估计SNP存在的平均数是每1000个核苷酸中有一个，但是在某些DNA区存在的频率更高一些。现在努力的焦点在于利用SNP来鉴定与疾病或药物反应有关的靶基因。但是，由于关联性不强，很多科学家和研究人员怀疑以个体SNP为基础对药物和疾病个性化的观点，从而单元型(Haplotype)分析的重要性浮现出来，成为SNP医学应用的关键方法。单元型是个体SNP沿着给定DNA片段的组织形式，这是普遍公知的。单元型的经典定义是单一染色体中趋向于在给定种群中共同从一代遗传到下一代的紧密连锁基因座的等位基因组合。分子单元型测定的另一方面是连锁不平衡图谱的绘制，其现在被认为是疾病基因的定位克隆中的重要工具，随着复杂表型的遗传学刨析，很多种应用就变得显而易见了。1989年以来，科学家们研究了各种分子单元型测定方法，他们利用基因组DNA的单分子稀释物(SMD)，以物理方法分离等位基因，或者通过等位基因特异性引物从杂合模板选择性扩增半合子DNA片段进行等位基因辨别。然而，只是针对短片段(大约500bp)开发了这些方法，但是最近分子单元型测定已应用于长范围的PCR(标记物间隔再扩大10-20倍)，并且使用CD4基因座作为开发这项分析方法的原型系统。也尝试过测定DNA序列单元型的其它方法，但是这些方法非常不成功、不可靠或者成本高。因此仍存在着对可靠、处理量大的经济型分子单元型测定方法的需要。专利技术概述本专利技术涉及通过鉴定基因中一个或多个异源序列位点来测定等位基因的方法。该方法可以用来测定具体基因的单元型，并且在很多领域具有应用价值，包括人白细胞抗原(HLA)类型的测定。本专利技术还涉及用于这种类型测定的试剂盒。本专利技术包括分离等位基因特异性核酸分子的方法。向包含一个或多个异源序列位点的单链核酸分子中，加入一中或多中异源序列位点特异性核酸引物，并且使其杂交。在一个实施方案中，各引物的3′端对应于靶异源序列位点的多态性位点。在这样的实施方案中，可以使该3′端进行单碱基延伸，连接于5′端与该异源序列位点特异性引物的3′端相邻的第二引物，或者可以延伸数个碱基。然后分离延伸的或连接的异源序列位点特异性杂交引物和核酸分子，并根据需要回收，用于进一步的基因型测定。在另一个实施方案中，各引物包含位于引物内的一个或多个多态性碱基，这样能够选择性去除与少于100％互补碱基杂交的引物，而100％互补碱基杂交的那些引物不受影响。本专利技术还涉及鉴定包含该等等位基因的核酸分子中的多个等位基因的方法。选择含有多个异源序列位点的单链核酸分子，向该核酸分子中加入两种引物，一种异源引物、一种同源引物。所述异源引物能够与位于同一核酸分子上5′异源序列位点的3′端的3′端异源序列位点杂交。所述异源引物的3′端碱基相应于所述异源序列位点的多态性碱基，这样只有在异源引物的3′端与所述单链核酸杂交时才发生延伸。所述同源引物能在位于5′异源序列位点的5′端位置与同一核酸分子杂交。这些引物与核酸分子杂交，并且延伸异源引物，这样就可复制位于引物之间的、核酸分子的所述5′异源序列位点，当延伸的异源引物达到同源引物时，同源引物起到终止异源引物延伸的作用。将核酸分子和延伸的异源引物变性，并分离和分析异源引物，以确定5′异源序列位点。利用这些信息确定新一套含有另一种异源引物和另一种同源引物的核酸引物，该新一套引物的异源引物能与5′异源序列位点杂交(该异源引物的3′端碱基相应于多态性碱基)，该5′异源序列位点位于相同核酸分子上另一个异源序列位点的3′端，该新一套引物的同源引物能在另一个异源序列位点的5′端与同一核酸分子杂交。重复前面的步骤，在每下一轮杂交/延伸中使用新的一套引物，直到在该核酸分子上鉴定出足够的异源序列位点，用来鉴定等位基因。可以用这种方式测定核酸分子的单元型。本专利技术还涉及鉴定核酸分子中多个等位基因的方法，包括向一组小珠加入含有多个等位基因的核酸样品，每一个小珠连接有两个不同的引物，各小珠上至少一个引物是对一种独特等位基因的引物，使一种独特等位基因的至少一种引物与该核酸样品的一部分杂交。将杂交的引物扩增，延伸杂交引物，产生延伸的引物核酸。然后将杂交的核酸样品和引物变性，并从小珠上除去核酸样品。延伸的引物然后与小珠上的第二种引物杂交，并扩增该第二种引物。然后对含有双重扩增引物的小珠进行分析，确定核酸样品中存在的等位基因。附图简要说明附图说明图1是说明应用本专利技术的等位基因特异性引物延伸方法鉴定等位基因的示意图。图2是说明应用引物大小标记方法的单碱基延伸多等位基因鉴定方法的示意图。图2A是说明应用引物大小标记方法的单碱基延伸多等位基因鉴定方法的示意图。图3是说明应用本专利技术的等位基因特异性连接和引物大小标记鉴定等位基因的示意图。图4是说明应用本专利技术的杂交和引物大小标记鉴定等位基因的示意图。图5是说明应用本专利技术的同源引物和异源引物组的多等位基因鉴定方法的示意图。图6A-6F是说明应用本专利技术的包含多种引物的荧光小珠鉴定多个等位基因的方法示意图。本专利技术的详细描述本专利技术以美国临时专利申请No.60/228,994为基础(该专利全文在这里引作参考)，涉及确定等位基因标记的方法。本申请自始至终使用下面的术语，并且定义如下等位基因给定基因的变体形式。这样的变体包括单核苷酸多态性、插入、反转、易位和缺失。抗生物素蛋白从功能上以其高亲合力、特异性结合生物素的能力定义的蛋白质家族。抗生物素蛋白是相当小的寡聚体蛋白，由四个相同的亚基组成，每一个亚基带有一个单一的生物素结合位点。因此每摩尔抗生物素蛋白能结合4摩尔的生物素。抗生物素蛋白包括(a)两栖动物、爬行动物和鸟类产生的蛋白质，所述蛋白质存在于它们的蛋中，称为抗生物素蛋白，和(b)链霉菌属阿维丁链霉菌(Streptomycesavidinii)产生的蛋白质，称为链霉抗生物素蛋白。这里使用的″抗生物素蛋白″包括所有的上述蛋白。生物素这里使用的″生物素″包括生物素、其中生物素通过加入烷基被修饰的商业生物素产品、和生物素衍生物如活性酯、胺、酰肼和巯基，所述衍生物在聚合物上有额外的反应基团如胺、酰基和烷基离去基团、羰基和烷基卤化物或米歇尔型受体。检测分子一般通过外部能源使核酸可检测和/或去除的与核酸共价连接的分子。这样的分子可以包括染料、可变重量分子(包括聚腺苷酸尾和聚胸苷酸尾)、可以与小珠(包括磁小珠)连接的接头、生物素、抗生物素蛋白、地高辛配基、地高辛配基抗体和本领域公知的其它类似材料。基因型在基因座上携带的特定等位基因。单元型表示若干紧密连锁基因座的集体基因型，为同一染色体上等位基因的完全序列。异源引物在严格条件下与一个独特等位基因杂交的引物。异源序列位点在确定的序列位点具有不同序列的两个等位基因被称为具有异源序列位点。同源引物与亲代双方的等位基因都杂交的引物。亲代等位基因含有一套来自母系一边的染色体和一套来自父系一边的染色体的哺乳动物二倍体细胞的等位基因。引物能够与DNA模板杂交的寡核苷酸。这里引述的所有的专利文献和参本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离带有特定等位基因的核酸分子的方法，包括：　　　　（ａ）将包含异源序列位点的核酸与至少一种对该异源序列位点特异的核酸引物杂交，生成杂交的核酸序列，其中所述至少一种特异性核酸引物只有当其与该异源序列位点杂交时才能延伸；　　　　（ｂ）将杂交的核酸序列置于允许所述至少一种核酸引物延伸的条件下；和　　　　（ｃ）将没有杂交的核酸序列和没有经历延伸的核酸引物与所述进行了核酸序列延伸的杂交的核酸序列分离。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘向军，
申请(专利权)人：戴诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：NO[挪威]