本发明专利技术提供了通过诱导ｍＲＮＡ表达并检测诱导的ｍＲＮＡ，来检测微生物，特别是生长缓慢的细菌如分枝杆菌属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）细菌存在的方法。本发明专利技术还提供了用于检测分枝杆菌属的寡核苷酸引物和探针。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过诱导mRNA表达并检测诱导的mRNA，来检测微生物，特别是分枝杆菌属(Mycobacterium)生长缓慢的细菌存在的方法。
技术介绍
尽管存在有效的抗菌疗法，结核病仍然是世界上致病和致死的主要根源，并越来越遍及全世界。结核性脑膜炎的早期诊断和治疗的迅速启动改善了这种疾病的后果，但是通过常规方法检测脑脊髓液(CSF)中的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)始终是一个挑战。诊断分枝杆菌的挑战在于结核分枝杆菌生物体数量少并且生长缓慢，从而限制了采用耐酸染色和培养技术检测(Molavi A和J.L.Lefrock.，Med.Clin.North.Am.69315-331.1985)。几个研究小组已描述了用于灵敏并特异性检测临床样本中结核分枝杆菌的PCR分析。通过PCR扩增特异性靶核酸序列直接鉴定临床样本中的分枝杆菌具有在感染的同一天诊断的能力。已将PCR技术应用于实际临床样本，但是受可检测样本量小、临床样本中存在的生物体量低、由于污染导致假阳性和存在PCR抑制剂等方面限制(Kox等，J.Clin Micro32672-678，1994)。检测的预测值极大地依赖于研究的临床样品中阳性结核分枝杆菌样本的发生率。Grosset和Mouton建议在PCR技术充分可靠并且存在内部和外部质量控制程序前，不应将PCR用于结核病的日常诊断(Grosset J.和Y Mouton.，Tubercle Lung dis 76183-184，1995)。在一次国际合作质量控制研究中，30个实验室中只有5个实验室正确地鉴定出所有20个样本中存在或不存在分枝杆菌DNA(Noordhoek G.T.J.Clin.Microbiology 342522-2525.1996)。该研究还显示缺乏特异性是比缺乏灵敏性更主要的问题。目前，基于扩增的检测技术还没有替代常规诊断技术(Piersimoni等，363601-3604，1998，J.Clin Microbioogy；另参见Piersimoni等，35193-196，1997，J.Clin Microbioogy)。副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratubreculosis)是一种慢性肠道病原菌，其可感染包括灵长类的许多不同的动物种类(Chiodini等，Comell Vet.74218-262，1984)。在100年前该生物体作为德国牛的肠道慢性炎症的病因首次鉴定出来。动物中约内氏病或副结核病的分类特征是感染的肠道中存在数百万杆菌型耐酸分枝杆菌及巨噬细胞而很少有另外的炎性细胞浸润。副结核分枝杆菌很难以来自这些动物的杆菌形式培养。动物中的多杆菌-少微生物型的副结核病的临床病理学谱令人想起人类中以瘤型麻风和结核样麻风为代表的极其严重的情况。近年来由于实验室中通过常规培养来鉴定这种物质不时遇到极大困难，所以极大地延缓了我们对结核分枝杆菌及由它引起的疾病的理解进程(Chiodini等，Clin.Microbiol.Rev.290-117，1989)。在英国尤其在高峰期，零售消毒牛奶中存在残留的结核分枝杆菌是非常危险的。因此，仍然需要检测分枝杆菌属，特别是检测结核分枝杆菌的灵敏、特异的方法。
技术实现思路
根据本专利技术的第一个方面，本专利技术提供了一种检测待测样本中微生物存在的方法，该方法包括将待测样本暴露于能诱导所述微生物中至少一个基因表达的诱导物下并检测从暴露于所述诱导物而被诱导的基因转录的mRNA的存在。在一个优选实施方式中，所述微生物可以为生长缓慢的细菌。优选生长缓慢的细菌包括，例如，疏螺旋体属(Borreliae)、片球菌属(Pediococcus)、支原体属(Mycoplasma)、和分枝杆菌属的株系。最优选本方法用于检测分枝杆菌属，特别是结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌(如鸟分枝杆菌副结核亚种(M.avium subsp.paratuberculosis))和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)。怀疑含有微生物的“待测样本”通常主要是取自用于检测所述微生物存在的个体的临床样本。检测特异性mRNA序列存在优选对从待测样本中分离的核酸制备物进行检测。该核酸制备物必须包含mRNA，然而，根据用于检测特异性mRNA存在的技术的特征，该核酸制备物没有必要是纯化的聚腺苷酸化mRNA制备物，并且，整个RNA制备物甚至同时含有RNA和基因组DNA的整个核酸制备物也适于作为起始原料。实质上，本领域已知的用于分离包含mRNA的核酸制备物的任何技术可以用于从待测样本分离核酸。优选的技术为US-A-5,234,809和EP-B-0389,063中描述的“Boom”分离方法。该方法可以用于分离同时含有RNA和DNA的核酸制备物，其基于在离液剂硫氰酸胍(GuSCN)存在下，二氧化硅颗粒的核酸结合特性。在一个优选实施方式中，检测从暴露于诱导物而被诱导的基因转录的mRNA存在的步骤包括进行扩增反应以扩增全长或部分mRNA并检测扩增反应的特异性产物。更优选地，扩增反应为反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)或依赖核酸序列的扩增(NASBA)。本领域熟知将RT-PCR用于检测特异性mRNA序列。可以在标准课本中找到进行RT-PCR并检测RT-PCR反应的特异性产物的方法，例如PCR方案方法和应用指南(PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications)，Eds Innis等，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，加利福尼亚，1990；生物分析中的PCR分子生物学方法(PCR inBioanalysisMethods in Molecular Biology)，卷92，S.J.Smeltzer编辑，Humana出版社，Totowa，NJ.，1998)。NASBA是扩增RNA的相对新的方法(参见Compton，自然(Nature)，35091-92(1991))。NASBA是本领域普通技术人员熟知的，并且描述于，例如US-A-5,409,818中。NASBA是体外大量产生靶RNA序列的有效方法，其可以检测原待测样本中存在的浓度非常低的靶RNA序列。NASBA方法是基于使用与PCR的引物组合类似的引物组合，但一个引物用启动子序列，如T7启动子修饰。已显示NASBA扩增的灵敏性和特异性与PCR相同并且比多数RT-PCR方案更好。由于NASBA方法是一种等温分析且依赖RNA酶H，所以它不能用于扩增DNA。NASBA优选按照如下步骤进行(a)组装反应混合物，该混合物包含适用于通过NASBA扩增靶微生物mRNA一段区域的NASBA P1和NASBA P2引物对(见下)、RNA指导的DNA聚合酶、水解RNA-DNA杂合体的RNA链而不水解单链或双链RNA或DNA的核糖核酸酶、识别NASBA P1引物中存在的启动子序列的RNA聚合酶以及核糖核苷三磷酸和脱氧核糖核苷三磷酸；(b)在允许NASBA扩增反应的反应条件下将反应介质与从怀疑含有微生物的待测样本中分离的核酸制备物一起温育；并且(c)检测和/或定量测定NASBA扩增反应的任何微生物特异性产物。可采用许多不同的方法检测NASBA反应的特异性产物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测待测样本中微生物存在的方法，该方法包括将待测样本暴露于能诱导所述微生物中至少一个基因表达的诱导物下并检测从暴露于所述诱导物而被诱导的基因转录的ｍＲＮＡ的存在。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：弗兰克卡尔森，
申请(专利权)人：挪其普公司，
类型：发明
国别省市：NO[挪威]
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