核酸三链体和四链体形成制造技术

本发明专利技术公开了杂多聚体三链体和四链体及其制备方法；诸如阳离子的加速剂在产生它们上的应用；荧光嵌入剂和荧光探针结合的非嵌入剂在检测它们上的应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
1.专利技术背景本专利技术涉及核酸多链体，更具体而言，涉及把它们生成三链体和四链体的方法，以及在分析中利用它们检测特异核酸的方法。2.相关技术描述互补碱基序列的两条单链核酸分子能够相互特异性结合，既为研究又为诊断工具提供了强大的基础。对单链分子与双链靶结合的能力以及双链分子与双链靶结合的能力的探索一直比这种“常规杂交”的探索不完全。与双链靶结合的能力比常规杂交具有潜在的优势。这些优势可部分源自下列事实双链靶不会变性，使得杂交条件“更温和”，为靶提供较少倾向于成为完全的无规卷曲。它们可部分源自下列事实碱基配对机制将至少部分不同于常规杂交，使得对于更有利的动力学和在杂交反应混合物中所需探针量的降低具有可能性。生成多链体的现有技术包括1)三链体的形成作为部分同源重组过程，这是一个由细菌蛋白RecA和其他生物中有相似功能的蛋白所介导的过程；2)在原位杂交过程中3-链结构的生成(例如，Bresser等的美国专利5,707,801)；以及3)依赖于Hoogstein型键合的3-链或4-链的复合体。这些现有技术未充分开发形成多链体的潜力。RecA-介导的过程需要蛋白。原位杂交过程是基于下列原理胞内双链靶会局部打开其双链结构，提供将依据常规杂交原理杂交的单链靶。据报道，依赖于Hoogstein型聚体的复合体受限于不是真正杂聚体的结构。而是它们要求给定的链应为多嘌呤或多嘧啶或与其很接近。参见，例如，Floris等，“阳离子对嘌呤-嘌呤-嘧啶三重螺旋在混合价盐溶液中形成的影响(Effect of cation on purine-purine-pyrimidine triple helix formation inmixed-valence salt solutions)”，260，Eur.J.Biochem.801-809(1988)。如同与三链体核酸的情形一样，有关四链体核酸的常规知识一直是这种特有的结构仅存在于相对极端条件下，针对相对窄的核酸种类。具体而言，Sen等(Nature 334364-366(1988))公开了富含鸟嘌呤的寡核苷酸在体外可自发自我装配成四链螺旋。Sen等(Biochemistry 3165-70(1992))公开了这些四链复合体可进一步结合成由8、12或16寡聚体组成的超结构。Marsh等(Biochemistry 3310718-10724(1994)和Nucleic AcidsResearch 23696-700(1995))公开了一些富含鸟嘌呤寡核苷酸也可以补偿、平行比对的方式组装，形成长的“G-丝”。这些高级结构由G-四联体所稳定，所述G-四联体由四个在平面上排列并通过Hoogsteen碱基配对结合在一起的鸟嘌呤残基组成。根据Sen等(Biochemistry 3165-70(1992))，寡聚体内至少三个邻近的鸟嘌呤对这些高级结构的形成是至关重要的。已有提示四链DNA在各种生物过程中发挥作用，如抑制HIV-1整合酶(Mazumder等，Biochemistry 3513762-13771(1996)，在减数分裂过程中染色体结合的形成(Sen等，Nature 334364-366(1988))，以及端粒维持(Williamson等，Cell 59871-880(1989)；Baran等，NucleicAcids Research 25297-303(1997))。另已有提示控制富含鸟嘌呤四链体的生产可能是控制这种生物过程的关键。例如，授予Hardin等的美国专利6,017,709提示端粒酶活性可通过抑制鸟嘌呤四联体形成的药物而得以控制。授予Pitner等的美国专利5,888,739公开了基于G-四联体的四链体可在分析中用于检测核酸。在与互补寡核苷酸杂交后，G-四联体结构解叠或线性化，由此增加供体和受体在不同部分的G-四联体结构之间的距离，导致它们相互作用增加以及从结构发出的信号(例如，荧光)可检测发生变化。授予Agrawal等的美国专利5,912,332公开了合成寡核苷酸的纯化方法，其中所述合成寡核苷酸特异性与期望的全长寡核苷酸杂交，同时形成多聚体聚合体，如四链体DNA。多聚体聚合体含有待纯化的寡核苷酸，然后利用大小排阻层析技术分离。尽管有上述进展，但是对四链体核酸的潜力既没有充分地得到理解也没有完全地加以开发。有关用双链靶进行杂交型试验的问题在于检测它们的方法。荧光染料数十年来一直用于检测和定量核酸。以其最基本的形式，基于荧光强度的分析通常包括将靶与含荧光团的探针接触，从结合探针中除去任何未结合的探针，以及检测清洗样品中的荧光。在这种基本分析基础上，匀相分析的改进在于其不需要清洗步骤或者提供非液相支持物。例如，授予Livak等的美国专利5,538,848和授予Maggio的美国专利4,220,450公开了在溶液中利用寡核苷酸探针来基于匀相荧光分析核苷酸序列。然而，这些专利需要利用猝灭剂与支持剂组合，从而区分由杂交探针和未杂交探针所产生的信号。Livak等在其公开方法中还需要利用酶。猝灭剂和酶给方法增添了复杂性和花费。授予Kidwell的美国专利5,332,659公开了利用含有至少两个荧光团部分的探针检测溶液中核苷酸序列的方法。荧光团的选择必须是当相互之间足够接近时可以电子上相互作用以改变它们波谱的波长依赖性。未杂交探针比与靶序列杂交的探针更具柔性，结果，探针未杂交比探针杂交时，各探针上的两个荧光团部分更可能相互靠近。因此，与游离探针相关的辐射波长的变化可作为样品中游离探针量的指标而加以监控。授予Wu等的美国专利5,846,729也公开了基于匀相荧光的分析用于检测核酸。除了前述检测荧光强度的进展以外，一些文献还极力称赞荧光偏振分析的优点。然而，基于偏振分析存在显著的缺陷。偏振的变化程度作为结合的函数是不可预测的，以及对数据的解释以使不一致数据符合理论预计，可能要求比分析方法中所期望的更多努力，尤其是当所述方法务必自动化时。还存在一些限制，来自其运动在荧光偏振分析中得以评估的分子的分子量。本专利技术将会看到，在多种重要的实施方案中，为了检测三链体和四链体而利用荧光分子的特性。所有在此引用的文献以其全文引作参考。专利技术简述产生多链体的方法在一总的方面，本专利技术为一种产生核酸多链体的方法，所述方法包括下列步骤1)产生含有水、沃森-克里克双链体、足够数目的单链混合碱基序列分子的混合物以形成多链体，所述多链体包括沃森-克里克双链体以及提高多链体形成速率或量的加速剂，所述多链体为三链体或四链体，其中一种或多种所述单链分子加以选择，以致如果在多链体中，它们分别与多链体的其他所有链通过遵守碱基配对法则而相关，所述法则或者是沃森-克里克碱基配对法则或者是匀相结合碱基配对法则；以及2)将所述混合物温育，以使多链体形成，所述多链体的各条链通过碱基配对法则与多链体的其他所有链相关；条件是，在多链体内，步骤(1)中加入的沃森-克里克双链体为G-C含量在10％和90％之间的杂多聚体。在方法的一个特定方面，所产生的多链体为三链体，在步骤(1)中，单链分子的足够数目为1，以及在步骤(2)中，形成三链体。在方法的特定实施方案中，在三链体中，单链分子通过沃森-克里克碱基配对法则与双链体的一条链相关，并且通过同本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生核酸多链体的方法，所述方法包括下列步骤：１）产生含有水、沃森－克里克双链体、足够数目的单链混合碱基序列分子的混合物以形成多链体，所述多链体包括沃森－克里克双链体以及含有提高多链体形成速率或量的加速剂，所述多链体为三链体或四链 体，其中一种或多种所述单链分子加以选择，以便如果在多链体中，它们分别与多链体的其他所有链通过碱基配对法则而相关，所述法则或者是沃森－克里克碱基配对法则或者是同源结合碱基配对法则；以及２）将所述混合物温育以使多链体形成，所述多链体的各 条链通过碱基配对法则与多链体的其他所有链相关；条件是，在多链体内，步骤（１）中加入的沃森－克里克双链体为Ｇ－Ｃ含量在１０％－９０％之间的杂多聚体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：格伦H埃里克森，亚斯曼I戴克斯，伊万娜坎迪奇，皮埃尔皮卡德，
申请(专利权)人：英詹尼斯公司，
类型：发明
国别省市：BB[巴巴多斯]