利用嵌合寡核苷酸引物高灵敏度并特异地扩增样品中目标核酸所用的反应试剂的稳定化方法，及该反应试剂的长期保存方法；以及致病微生物和病毒的高灵敏度检测方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及稳定和保存反应试剂的方法，所述反应试剂用于扩增和/或检测目标核酸的方法，所述目标核酸在遗传工程和临床医学领域是有用的。
技术介绍
DNA合成在遗传工程领域的研究中可被用于多种用途。除短链DNA(如寡核苷酸)合成以外，大部分DNA合成采用酶法进行，其中利用了DNA聚合酶。典型方法是如美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159所详细描述的聚合酶链反应(PCR)方法。另一个实例是如Trends in Biotechnology，10146-152(1992)所描述的逆转录-PCR(RT-PCR)方法。可选地，也可采用如EP320,308所描述的连接酶链反应(LCR)方法，或者如PCR Protocols，Academic Press Inc.，1990，pp.245-252所描述的以转录为基础的扩增体系(TAS)。上述四种方法需在高温和低温重复反应若干次，以再生下一个扩增循环所需的单链目标分子。由于反应受限于上述温度，所以应采用不连续相或循环来处理该反应体系。因此，这些方法需利用昂贵的热循环装置，该装置可随时间精确调节宽范围的温度。此外，该反应需要时间将温度调节至二或三个预定温度。损失时间的增加与循环数成比例。为解决这些难题，已研究出可恒温进行核酸扩增的方法。其实例包括如JP-B 7-114718所描述的链替代扩增(SDA)方法、自维持序列复制(3SR)方法、如日本专利No.2650159所描述的以核酸序列为基础的扩增(NASBA)方法、转录介导的扩增(TMA)方法、如日本专利No.2710159所描述的Qβ复制酶方法，以及如美国专利No.5,824,517，WO 99/09211、WO 95/25180和WO 99/49081所描述的多种改良SDA方法。美国专利No.5,916,777描述了一种恒温酶促合成寡核苷酸的方法。在这种恒温扩增核酸或合成寡核苷酸方法的反应中，起自引物的延伸和/或将引物退火至单链延伸产物(或至原始目标序列)，继而从该引物的延伸平行地发生于恒温温育的反应混合物中。在恒温核酸扩增方法当中，SDA方法是最终扩增DNA的体系中的一个实例。SDA方法是采用DNA聚合酶和限制性内切核酸酶，通过取代双链，扩增样品中目标核酸序列(和其互补链)的方法。该方法需四个用于扩增的引物，其中两个应被设计为含有供限制性内切核酸酶识别的位点。该方法需利用修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸作为大量合成DNA的底物。经过修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸的一个实例是(α-S)脱氧核糖核苷酸三磷酸，其α-位磷酸基团的氧原子被硫原子(S)所取代。如果按常规进行该反应，例如用于遗传试验，与利用该修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸相关的操作成本问题就变得严重了。此外，该方法中将修饰的核苷酸(如(α-S)脱氧核糖核苷酸)整合进扩增的DNA片段，可能破坏限制性内切酶对所扩增DNA片段的可切割性，例如，当在限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)分析中。如美国专利No.5,824,517所描述的改良SDA方法是采用嵌合引物的DNA扩增方法，该嵌合引物由RNA和DNA组成，且作为基本要素具有DNA至少位于3’末端的结构。如WO 99/09211所描述的改良SDA方法需利用可生成3’凸出末端的限制性内切酶。如WO95/25180所描述的改良SDA方法需利用至少两对引物。如WO99/49081所描述的改良SDA方法需利用至少两对引物和至少一个修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸。另一方面，如美国专利No.5,916,777所描述的寡核苷酸合成方法包括采用3’末端具有核糖核苷酸的引物合成DNA，利用该引物完成反应，用内切核酸酶将一个缺口导入引物-延伸链的引物与延伸链之间以使其彼此分离，消化模板并回收引物以重复利用。为重复利用该方法中的引物，需从该反应体系分离出该引物，并再次将其退火至模板。此外，如WO 00/28082所描述的环介导恒温扩增(LAMP)方法需四个引物进行扩增，且该方法扩增的产物是不同大小的DNA，其中用于扩增的目标区域是重复的。此外，采用嵌合寡核苷酸引物的恒温核酸扩增方法，如WO00/56877或WO 02/7139所描述的恒温和嵌合引物启动的核酸扩增(ICAN)方法是已知的。由于上述方法所用的许多反应试剂在室温不稳定，因此大部分情况下试剂用于操作的同时需在冰上进行冷却。此外，由于大部分反应试剂应于4℃或以下、或-20℃或以下保存，因此需要严格注意保存方法。因而需要一种无需冰箱或制冷机，可于室温长期稳定保存反应试剂的稳定化和/或保存方法。专利技术目的本专利技术的主要目的是提供一种利用嵌合寡核苷酸引物高灵敏度、特异地扩增样品中目标核酸所用反应试剂的稳定化及长期保存方法，以及致病微生物或病毒的高灵敏度检测方法。专利技术概述专利技术人深入研究的结果是发现了一种在嵌合寡核苷酸引物、内切核酸酶和DNA聚合酶存在下扩增感兴趣的DNA区域，以检测病毒或致病微生物的高灵敏度方法。专利技术人进一步发现一种扩增感兴趣的DNA区域所用试剂的稳定化和长期保存方法。从而完成了本专利技术。本专利技术的第一个方面涉及扩增和/或检测目标核酸所用反应试剂的稳定化方法，包括(a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链替代活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNase H混合，以制备反应混合物，其中的引物是与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸，以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中至少一种的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于引物3’末端或3’末端一侧；和(b)通过温育该反应混合物足以生成反应产物的时间以扩增目标核酸，其中(i)至少一种选自镁盐、嵌合寡核苷酸引物和酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂组分在反应前是与其它试剂组分分离的；及(ii)含酶的试剂溶液的酶浓度被提高了，而该溶液的盐浓度未被提高，且另一试剂溶液的盐浓度被调整，以使彼此分离的试剂溶液混合后可达到扩增步骤所需的最佳盐浓度。根据第一个方面，反应试剂可由两种试剂溶液组成含嵌合寡核苷酸引物的试剂溶液；含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)和镁盐的试剂溶液。含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂溶液的盐浓度可等于或低于扩增步骤所需最佳盐浓度。含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂溶液的酶浓度可高于扩增步骤所需酶浓度。含酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂溶液的酶浓度可被调整，以使彼此分离的试剂溶液混合后达到扩增步骤所需的最佳酶浓度。本专利技术的第二个方面涉及扩增和/或检测目标核酸所用反应试剂的试剂盒，包括(a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链替代活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNase H混合，以制备反应混合物，其中的引物是与作为模板的核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸，以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中至少一种的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于引物3’末端或3’末端一侧；和(b)通过温育该反应混合物足以生成反应产物的时间以扩增目标核酸，其中(i)至少一种选自镁盐、嵌合寡核苷酸引物和酶(DNA聚合酶和/或RNase H)的试剂组分在反应前是与其它试剂组分分离的；及(ii)含酶的试剂溶液的酶浓度被提高了，而该溶液的盐本文档来自技高网...
【技术保护点】
扩增和／或检测目标核酸的方法中所用的反应试剂的稳定化方法，包括：（ａ）将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链替代活性的ＤＮＡ聚合酶、至少一种引物和ＲＮａｓｅＨ混合，以制备反应混合物，其中的引物是与作为模板的核酸的核苷酸序 列基本互补，并含有核糖核苷酸，以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中至少一种的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于引物３’末端或３’末端一侧；并（ｂ）通过温育该反应混合物足以生成反应产物的时间以扩增目标核酸，其中（ｉ ）至少一种选自镁盐、嵌合寡核苷酸引物和酶（ＤＮＡ聚合酶和／或ＲＮａｓｅＨ）的试剂组分在反应前是与其它试剂组分分离的；及（ｉｉ）含酶的试剂溶液的酶浓度被提高，而该溶液的盐浓度未被提高，且另一试剂溶液的盐浓度被调整，以使彼此分离的试 剂溶液混合后可达到扩增步骤所需的最佳盐浓度。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：佐川裕章，上森隆司，向井博之，山本纯子，友野润，小林英二，榎龙嗣，浅田起代藏，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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