新的神经毒性的分子靶制造技术

本发明专利技术涉及生物学，遗传学和医学领域。具体而言，本发明专利技术涉及检测，鉴定和／或治疗（或者控制）神经退行性疾病，尤其是肌萎缩侧索硬化症的新方法。本发明专利技术同时涉及鉴定或者筛选对这些疾病有活性的化合物的方法。本发明专利技术进一步涉及用于实施上述方法的化合物，基因，细胞，质粒或者组合物。特别地，本发明专利技术描述了ＰＤＥ４Ｂ在这些疾病中的作用及其作为治疗、诊断或者试验靶的应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物学，遗传学和医学领域。本专利技术具体涉及检测，鉴定和/或治疗(或者控制)神经退行性疾病，尤其是肌萎缩侧索硬化症的新方法。本专利技术同时涉及鉴定或者筛选对这些疾病有活性的化合物的方法。本专利技术进一步涉及用于实施上述方法的化合物，基因，细胞，质粒或者组合物。本专利技术主要来自于鉴定磷酸二酯酶4B在这些疾病中的作用并且描述了磷酸二酯酶4B作为这些病症中的靶或者治疗、诊断或者试验标记的应用。很多神经退行性疾病被描述为具有与兴奋毒性现象相关的组分或者阶段。这种情形诸如阿默氏症，帕金森症，多发性硬化和亨汀顿舞蹈症。肌萎缩侧索硬化症(或者称作ALS)是伴随着不同类型的诸如路易士小体的包含体，并且特征在于脊髓和皮层运动神经元的细胞程序性死亡的神经退行性疾病，所述皮层运动神经元的死亡有时相关于额叶性痴呆症。没有突变记述的散发形式和与编码超氧化物歧化酶的SOD1基因的突变相关的家族性形式(FALS)共存。大多数病例是散发的，家族性形式(FALS)非常少见。很可能是长时间的无症状时期存在于临床症状出现之前，这些临床症状多变并难以分类。未来在治疗上的发展将使得用基于疾病分子原因的治疗策略代替症状性治疗成为可能。在细胞水平，这些症状相关于皮层运动神经元和脊髓运动神经元的死亡。这种神经元的死亡已经与不同的现象联系起来，这些现象是多种神经退行性疾病的基础。诸如与谷氨酸，氧化应激，针对神经元标记(在ALS情况下的钙通道)的自身免疫，以及细胞骨架异常联系起来的兴奋毒性的情况。虽然这些现象是已知的，但是包括ALS的这些疾病的一个或者多个病因仍然不清楚。即使FALS相关于编码超氧化物歧化酶的SOD1基因的突变，但是神经元开始进行细胞死亡的机制还是未知的，所述细胞死亡中至少一种是细胞程序性死亡。阐述参与涉及细胞死亡的不同现象的分子事件将许可开发新的治疗策略。利用人活体组织检查样本很难进行这些事件的研究。这些活体组织检查样本显然来自于死后样品，这些样本的质量很难控制并且仅仅反应疾病的最后阶段出现的病理状态。动物模型提供的生物样品使得不同发病阶段的分析和与健康对照的比较成为可能。就这一点来讲，如果使用许可获自西北大学(Northwestern University)，表达携带在FALS中普遍流行的一种突变(突变G93A)的人SOD1基因的转基因小鼠可获自Jackson实验室。这个模型在120天内重现具有类似于人类疾病的那些症状的疾病的致死结果。相关于SOD1基因的突变G93A的ALS症状的出现并非产生于超氧化物歧化酶活性的降低而是由于酶产生自由基能力的增强引起的。尽管拥有了这方面的认识，控制ALS不同阶段的分子事件依然知之甚少。这些分子事件的复杂性反应了疾病的进展在所研究的转基因模型中，在30天没有观察到神经元的异常或者临床表现。60天是症状出现不久之前的一个阶段，但是大脑已经具有细胞生理改变的特征，诸如线粒体代谢的改变，与兴奋毒性现象相关的应激和神经元死亡。在90天，50％的皮层和脊髓运动神经元死亡并且伴随着星形胶质细胞的激活开始了神经元细胞程序性死亡的活动过程。在这个阶段不再观察到兴奋毒性的现象。神经元死亡与半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)的激活相关，所述半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的激活似乎没有参与疾病的早期阶段。阐明特异于疾病不同阶段的不同分子事件应允许鉴定新的治疗靶以及新的治疗标记。进行这种鉴定的一种最有效的方法在于鉴定基因和蛋白，所述蛋白的表达表征了病理生理状态。本专利技术描述了鉴定参与兴奋毒性现象和神经元死亡的遗传事件。因此，本专利技术给相关于这些现象的疾病提供了新的治疗和诊断方法以及鉴定活性化合物的新的靶子。更具体而言，对于提取自大脑和脊髓样品的RNA已经进行了定性差异分析，没有预先提取神经元目的是考虑与疾病发展相关的最大程度的选择性剪接事件。根据DATAS的方法(描述于申请WO99/46403中)通过定性差异筛选进行分析，所述方法具有无与伦比的优点。本专利申请特别来自于申请人在60天龄ALS模型动物的大脑中选择性剪接的所有组成成分的构建物。这种含有多于200个不同序列的所有组成成分包括兴奋毒性现象中的主要参与成分，诸如钾通道和NMDA受体。来自编码参与应激反应的蛋白，包括热激蛋白的RNA的序列也是所有组成成分的组成部分，强调了后面的应激在ALS早期阶段的作用。改变的能量代谢明显表现出影响发生该种疾病的动物的皮层运动神经元。例如，线粒体肌酸激酶的内含子6特异性分离自60天龄的动物在病理状态下表达的信使RNA。通过保持这个内含子中断编码序列产生编码失活形式的酶的信使RNA。这个观察结果与下列生化发现一致线粒体肌酸激酶活性的减少与这种酶的量在相同转基因模型动物的神经元中的减少相关。构成所有组成成分的序列特异性通过下列事实得以证实在90天龄的动物中，对基因表达进行相同定性差异分析导致不同的所有组成成分，在所有组成成分中，尤其是缺乏兴奋毒性的不同标记。剪接修饰的分析证实疾病的阶段不同，分子事件相异。以特别有趣和意想不到的方式，对来自60天龄的转基因动物和对照动物的RNA进行DATAS分析引起从来自磷酸二酯酶4B的mRNA分离cDNA片段。这种片段相应于特异性存在于对照动物中的外显子片段，并因此在60天阶段的SOD1G93A转基因动物体内特异性缺失。这种片段跨越从小鼠PDE48终止子编号的核苷酸377到486(SEQ IDNO1)(序列也可获自GenBank，登录号AF208023)。这个序列包括2912个碱基，缺失的片段相应于碱基2760到2869。这是一个非编码区并且在对照动物和转基因动物中差异表达，原因在于选择性使用非编码3’外显子或者是使用两种选择性聚腺苷酸化位点。这种差异表达已经通过示于图1A和1B中的RT-PCR试验加以阐明。因此，本申请阐述了磷酸二酯酶4B参与了兴奋毒性过程的发展以及神经元的死亡。获得的结果表明PDE4B在病理性神经组织中高水平表达，所述表达与相应的RNA的结构修饰有关，尤其是与在3’非编码部分区域的缺失有关。这个结果与通过DATAS在序列中鉴定到的mRNA不稳定序列完全一致。通过剪接或者通过使用选择性聚腺苷酸化序列，它们在PDE4B mRNA中的缺失能够引起稳定化，从而提高这个RNA编码部分的表达。这个事件特异性发生在病理受试者而非对照受试者的大脑中。因此本专利技术描述了引起PDE4B mRNA在病理受试者大脑中表达提高的最初分子事件，并且所述原始分子事件随着时间的推移相关于兴奋毒性现象和/或神经元的死亡。此外，本专利技术首次表明PDE4B表达的提高相关于ALS的早期阶段。因此PDE4B是这些疾病的治疗发展中的一个新的和重要的治疗靶，尤其是用于这些疾病发展的早期阶段，并且提出了疾病的真正分子基础而非并发症或者炎性组分。本专利技术也提供了诊断，筛选，检测，确定这些疾病的趋势或者监控这些疾病的进展或者治疗效果的新方法。检测，诊断和筛选因此，本专利技术的一个目的就是提供检测受试者兴奋毒性状态或者神经元应激的方法，所述方法包括测定来自受试者的样品中磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的体外表达。本方法优选包括测定PDE4B基因的3’非编码区和基因的其它区，尤其是编码区的差异表达。因此本专利技术的进一步的目的就是提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测受试者兴奋毒性状态或者神经元应激状态的方法，所述方法包括体外测定来自受试者的样品中磷酸二酯酶４，尤其是磷酸二酯酶４Ｂ的表达。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿里艾特伊赫列夫，安内利斯热欣卡，法比安施魏格霍费尔，
申请(专利权)人：埃克森海特治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]