口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种以口蹄疫病毒基因片段为靶目标，应用ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ软件和ｐｒｉｍｅｒ　ｐｒｅｒｅ５．０软件设计合成的生物制剂，尤其是能够对口蹄疫病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法。本发明专利技术所述的口蹄疫病毒荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针。本首次用ＦＭＤＶ　　３Ｄ区域的基因序列的最保守片段，设计合成了引物和探针，建立了荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ并制备成检测试剂盒，可对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品中的ＦＭＤＶ进行快速检测，首次创立ＦＭＤＶ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种以口蹄疫病毒基因片段为靶目标，应用primer Express软件和primer prere5.0软件设计合成的生物制剂，尤其是能够对口蹄疫病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的野生、家畜偶蹄动物的一种高度传染性的疾病。快速和可靠的诊断对于FMD的控制至关重要，为采取有效措施，实验室诊断必须在24小时以内作出快速、准确的结论。动物和肉类产品带病毒引发口蹄疫是多次大流行的主要原因。对肉食品中低含量的FMD病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法必须具备高敏感性、高特异性和高准确性。常规的诊断方法如病毒分离、血清学试验、动物试验等，或费时费力，或特异性和敏感性不高，不能满足快速、准确诊断的要求。RT-PCR、竞争PCR和ELISA-PCR方法克服了这些方法的不足，可用于FMD的诊断，但也有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用FMDV 3D区域的基因序列设计合成的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂。本专利技术的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。本专利技术选择FMDV基因的3D区为靶目标，通过对GenBank中报道的FMDV DNA序列(AF536534、AF536535、AF536536、AF536540、AF536537、AF536538、AF536539)进行同源性分析比较，选定FMDV 3D区内较保守的片段(189bp)，应用primerExpress软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针，引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定扩增效率和特异性最好的二套引物和探针。通过FMDV病毒RNA和标准阳性对照样品的制备，采用矩阵法进行引物和探针最佳浓度的精确筛选，以获得最低的CT值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。通过建立标准曲线，然后用FMDV细胞培养物、乳鼠组织、VSV、BTV17、BVDV、正常BHK21细胞、猪牛的上皮组织等试验样品进行检测，对FMDV荧光定量RT-PCR的特异性、敏感性和重复性试验，以及各参加反应组份最佳条件的筛选，最终建立FMDV荧光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序。由上述确定扩增效率和特异性最好的二套引物和探针分述如下本专利技术所述的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为86bp，引物和探针序列为引物FVP2-F5’-TTA CAA ACC TGT GAT GGC CTC-3’FVP2-R5’-CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA TG-3’探针(FAM)5’-CCT CTC CTT TGC ACG CCG TGG-3’(TAMRA)。本专利技术所述的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为135bp，引物和探针序列为引物FVP3-F5’-CGT GGG ACC ATA CAG GAG AA-3’FVP3-R5’-CGC AGG TAA AGT GAT CTG TAG CTT-3’探针(FAM)5’-TGA TCT CCG TGG CAG GAC TCG C-3’(TAMRA)。本专利技术所述的口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法由以下步骤组成一、选择FMDV基因的3D区为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序为列TTACAAACCTGTGATGGCCTCAAAGACCCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCG； 二、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针；三、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定并得到扩增效率和特异性好的引物和探针。本专利技术的优点和积极效果为1、本申请人首次用FMDV 3D区域的基因序列的最保守片段，设计合成了引物和探针，建立了荧光定量RT-PCR并制备成检测试剂盒，可对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品中的FMDV进行快速检测，首次创立FMDV荧光定量RT-PCR。2、本试剂与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可定量，可同时检测大量样品等优点。FMDV荧光定量RT-PCR可对肉食品中低含量的FMD病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，是一种FMDV检测的良好方法。3、本试剂可对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品等多种样品中的FMDV进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安全的优点。4、本荧光定量RT-PCR试剂除了具有特异性高、敏感性强外，可同时进行大量样品检测，具有高通量性，可减少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险。比常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析。克服了常规RT-PCR和免疫捕获RT-PCR产生的产物须电泳检测、费时、不敏感和不能定量的缺点。5、与常规PCR相比，荧光PCR作出一个定量的、客观的估计，判定出阳性、阴性和可疑。CT值为40.00可确定为阳性和阴性的临界值(cut-off)。更重要的是，荧光PCR具有很高的外、内试验重复性。荧光RT-PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。6、本试剂可在收到样品后4小时之内作出定性、定量检测结果。与FMDVELISA检测结果的阳性检出率低、细胞培养分离病毒需要4天时间相比。该荧光RT-PCR试剂是一种检测临床样品中FMDV的敏感和可靠的方法。具体实施例方式1、设计引物和探针本专利技术选择FMDV基因的3D区为靶目标，通过对GenBank中报道的FMDV DNA序列(AF536534、AF536535、AF536536、AF536540、AF536537、AF536538、AF536539)进行同源性分析比较，选定FMDV 3D区内较保守的片段(189bp)，应用primerExpress软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针，引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定扩增效本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种口蹄疫病毒荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂，其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为８６ｂｐ，引物和探针序列为：引物：ＦＶＰ２－Ｆ：５’－ＴＴＡＣＡＡＡＣＣＴＧＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣ －３’ＦＶＰ２－Ｒ：５’－ＣＧＧＡＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＡＴＧ－３’探针：（ＦＡＭ）５’－ＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧ－３’（ＴＡＭＲＡ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：花群义，徐自忠，董俊，杨晶焰，周晓黎，杨云庆，
申请(专利权)人：云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]