本发明专利技术涉及一种以水泡性口炎病毒基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对水泡性口炎病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法。本发明专利技术系选择水泡性口炎病毒Ｎ基因的保守片段为靶目标，应用ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ软件和ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｒｅ５．０软件，设计合成引物和探针。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最适合的引物和探针。本发明专利技术所述的水泡性口炎病毒荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为９７ｂｐ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种以水泡性口炎病毒基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对水泡性口炎病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法。
技术介绍
水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Virus，VSV)属于弹状病毒科水泡病毒属的病毒。分为两个血清型新泽西型(VSV-NJ)和印第安那型(VSV-IND)。它是牛、猪、马的流行性和散发性疾病，还可感染其它许多哺乳动物。人对此病毒易感，可产生类似流感样症状和口腔、手足的水泡。牛、猪、马感染后引起严重的口腔粘膜、乳头皮肤及蹄冠皮肤出现水泡及糜烂，造成巨大的经济损失。临床症状与口蹄疫(FMD)、水泡病(SVD)和水泡疹(VE)很相似，不易区别。VSV的病原学、病毒持续存在等许多方面尚不完全清楚，比如病毒的贮存者。感染VSV 8年后的牛血清中还可检测到高水平的中和抗体，有迹象表明，临床健康牛的调运可传播VSV。因此，VSV可能持续存在于宿主体内。昆虫和植物也可能成为VSV潜在的贮存者，节肢动物媒介可以传播VSV。由于感染后几天才能产生抗体，或者感染后抗体滴度迅速下降，以及疫苗免疫的影响，血清学检测方法的结果难以作出准确判定。病毒分离方法费时，不能作出快速诊断，且需要选用敏感的宿主或细胞。野外分离病毒很难在细胞培养中繁殖，VSV病毒血症中可检测到病毒，有时只检测到短暂的或低滴度病毒。因此，研究建立特异、敏感、可对低含量VS病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究具有重要意义。检测VSV特异性核酸的最好方法是反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，它将高敏感性、高特异性和高准确性结为一体，不像细胞培养分离病毒时易受临床样品中中和抗体的干扰，是研究VSV病原学和持续感染的良好检测方法。近几年发展起来的TaqMan实时荧光定量RT-PCR将PCR与荧光检测相结合，克服了传统PCR费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点，可对样品中的VSV进行准确的定量检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已成为病原体检测的重要方法。动物和肉类产品带病毒引发水泡性口炎是多次大流行的主要原因。对肉食品中低含量的水泡性口炎病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法必须具备高敏感性、高特异性和高准确性。常规的诊断方法如病毒分离、血清学试验、动物试验等，或费时费力，或特异性和敏感性不高，不能满足快速、准确诊断的要求。RT-PCR可用于VS的诊断，但也有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用水泡性口炎病毒N基因序列设计合成的水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂。本专利技术的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。本专利技术系选择水泡性口炎病毒N基因的保守片段为靶目标，应用primerExpress软件和primer prere5.0软件，设计合成引物和探针。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最适合的引物和探针。本专利技术所述的水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为97bp，引物和探针序列为引物VSV-F-RT-P5’-ATG GCT CCT ACA GTT AAG AGA ATC A-3’VSV-R-RT-P5’-TGA AGT AAT CAG CCG GGT ATT C-3’探针(FAM)5’-CGA AAT TAC CGG CCA ACG AGG ATC-3’(TAMRA)本专利技术所述的水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法由以下步骤组成一、选择VSV N基因的保守片段为靶目标，其基因片段的增目标核苷酸序列为ATGGCTCCTACAGTTAAGAGAATCATTAACGACTCAATTATTCAGCCGAAATTACCGGCCAACGAGGATCCGGTCGAATACCCGGCTGATTACTTC； 二、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针；三、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定并得到扩增效率和特异性好的引物和探针。本专利技术的优点和积极效果为1、本试剂与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点。水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR可对肉食品中低含量的VS病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，是一种VSV检测的良好方法。2、本试剂可对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品等多种样品中的VSV进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安全的优点。3、本荧光定量RT-PCR试剂除了具有特异性高、敏感性强外，可同时进行大量样品检测，具有高通量性，可减少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险。比常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析。克服了常规RT-PCR和免疫捕获RT-PCR产生的产物须电泳检测、费时、不敏感和不能定量的缺点。4、与常规PCR相比，荧光定量PCR作出一个定量的、客观的估计，判定出阳性、阴性和可疑。CT值为40.00可确定为阳性和阴性的临界值(cut-off)。更重要的是荧光定量RT-PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。5、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后4小时之内作出定性、定量检测结果。该荧光定量RT-PCR试剂盒是一种检测临床样品中VSV的敏感和可靠的方法。具体实施例方式1、VSV N基因重组质粒的构建按照花群义等《水泡性口炎病毒核蛋白基因的克隆和序列分析》，中国生物制品学杂志，2004年第1期，第4页至第7页，进行水泡性口炎病毒N基因克隆和测序，构建VSV N基因重组质粒，将重组质粒命名为pBAD-VN5。2、设计引物和探针本专利技术选择VSV N基因的保守片段为靶目标，通过对GenBank中报道的VSVN基因的DNA序列和上述1克隆和测序的水泡性口炎病毒N基因DNA序列进行同源性分析比较，选定VSV N基因的保守片段(97bp)，应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针，引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定扩增效率和特异性最好的一对引物和一条探针，扩增目标片段长度为97bp。3、RNA提取水泡性口炎病毒RNA和标准品同时制备。参照黄祯祥主编《医学病毒学基础及实验技术》，科学出版社(1990年)第143-146页，先测定毒价，以Reed和Muench氏法计算TCID50。取100μL病毒原液，参照卢圣栋主编《分子生物学实验室常用技术》，科学出版社(1999年)第61-62页，酚/氯仿核酸抽本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水泡性口炎病毒荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂，其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为９７ｂｐ，引物和探针序列为： 引物：ＶＳＶ－Ｆ－ＲＴ－Ｐ：５’－ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＣＴ ＡＣＡ ＧＴＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＴＣ Ａ－３’ ＶＳＶ－Ｒ－ＲＴ－Ｐ：５’－ＴＧＡ ＡＧＴ ＡＡＴ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＴＴ Ｃ－３’ 探针：（ＦＡＭ）５’－ＣＧＡ ＡＡＴ ＴＡＣ ＣＧＧ ＣＣＡ ＡＣＧ ＡＧＧ ＡＴＣ－３’（ＴＡＭＲＡ）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：花群义，徐自忠，董俊，杨晶焰，杨云庆，周晓黎，贾建军，肖荣海，龙忠保，
申请(专利权)人：云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]
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