本发明专利技术公开了一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片及其制备方法和用途。在载体上设有如下探针：ＡＤＨ３：５’ －ＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＴＡＴ ５’ －ＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＴＴＡＴ ５’ －ＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＡＡＴ ＴＴＧ ＴＴＡＴ ５’ －ＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＴＧ ＴＴＡＴＡ ＤＨ２（等位基因１和等位基因２）：５’ －ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＣＧ ＣＡＣ ＡＧＡ ＴＧ ５’ －ＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＴＡＴ ５’ －ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＡＣ ＡＧＡ ＴＧ ５’ －ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＧＡ ＴＧ ＡＤＨ２（等位基因１和等位基因３）：５’ －ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＴＡ ＣＣＧ ＴＣ ５’ －ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＣＣ ＧＴＡ ＣＣＧ ＴＣ ５’ －ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＣＡ ＧＴＡ ＣＣＧ ＴＣ ５’ －ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＣＧ ＧＴＡ ＣＣＧ ＴＣ ＡＬＤＨ２：５’ －ＣＡＴ ＡＣＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＴＧＡ ＡＡ ５’ －ＣＡＴ ＡＣＡ ＣＴＡ ＡＡＧ ＴＧＡ ＡＡ ５’ －ＣＡＴ ＡＣＡ ＣＴＴ ＡＡＧ ＴＧＡ ＡＡ ５’ －ＣＡＴ ＡＣＡ ＣＴＣ ＡＡＧ ＴＧＡ ＡＡ。本发明专利技术的优点是：实施实现了对乙醇代谢酶相关基因ＡＤＨ２、ＡＤＨ３和ＡＬＤＨ２多态性快速、简捷、高通量检测，具有重要的社会和经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片及其制备方法和用途。
技术介绍
酒精滥用和酒精依赖已成为当今世界上日益严重的公共卫生问题，特别是青少年饮酒更值得人们重视。酒精性肝病过去在我国较少见，因此对其研究亦是不多，但近年来酒精性肝病的发病率明显增加，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。酒精对肝脏有明显的毒性作用，重度饮酒精者中80％以上有一定程度的脂肪肝，10％-35％可发展成酒精性肝炎，10％-20％将发展为肝硬化。酒精(乙醇)在体内代谢转化为乙醛和乙酸，主要为乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，ADH)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)作用。ADH有3种不同基因编码的同工酶ADH1(α)、ADH2(β)、ADH3(γ)，基中ADH2和ADH3存在一定的多态性，ADH2有三个等位基因位点，ADH2*1、ADH2*2和ADH2*3，分别编码β1、β2和β3三个亚单位，ADH2等位基因的多态性是由于47(GψA)和369(CψT)密码子的单一碱基置换，β1的同功酶对酒精具有低Km(0.049mmol/L)和低的最大清除率(Vmax)(0.23U/min)，β2.的同功酶比较具有低Km(0.94mmol/L)最大清除率(8.6U/min)，同功酶β3具有对酒精高Km(36mmol/L)和高Vmax(7.9U/min)。ADH3*1表达产物的活性是ADH3*2的2倍。ALDH2基因编码有活性和无活性的亚单位的等位基因分别被命名为ALDH2*1和ALDH2*2，这些同功酶的不同在于487密码子的碱基互换(GψA)，产生赖氨酸(无活性亚单位)和谷氨酸(活性亚单位)的互换。乙醇代谢酶相关基因的多态性在酒精性肝病以及其他代谢和药物性肝病的发病中有重要作用。用于SNPs做基因分析是特指检测人类基因组中大量存在的单核苷酸变异，这与疾病易感性和毒物易感性有关。SNPs不仅是人类种族和个体差异的标记，亦是决定不同人群种族和个体差异的标记，可以成为寻找疾病相关基因，进行疾病诊断、预防和药物筛选的基础。用于SNPs检测的常规方法有等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交，限制性内切酶法(RFLP)，位点特异性引物PCR(PCR-SSP)和直接测序等。基因芯片技术的发展为新的SNPs的检测方法提供了可能性。寡核苷酸芯片技术是新近发展起来的一种基因检测技术，它可将大量的寡核苷酸探针有规律地排列在一张玻片上，这些探针可以与信号显示物质标记的样品DNA的扩增序列的互补序列进行相结合，通过对信号物质进行检测，对杂交结果进行计算机软件处理分析，从而获得杂交信号的强度及其分布模式图。参考文献Khner M K，Beerli P，Yamato J，et al.Usefulness of single nucleatide polymorphismdata for estimating population parameters.Genetics，2000，156439-447Hirschlhorn J N，Sklar P，Lindblad-Toh K，et al.SBE-TAGSan array-based methodfor efficient single-nucleotide polymorphism genotyping.Proc Natl Acad SciUSA，2000，9712164-12169Picoult-Newberg L，Idker TE，Pohl M G，et al.Mining SNPs from ESTdatabases.Genome Res，1999，9167-174. 虞朝辉 陈李华，陈卫星等.醇代谢相关酶寡聚核苷酸基因芯片的制备和应用.中华消化杂志2003，23(11)；695-6
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片及其制备方法和用途。乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片在载体上设有如下探针ADH3 5’-AAG GTA AAA CAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA TAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA AAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA GAT TTG TTATADH2(等位基因1和等位基因2)5’-AAT CTG TCG CAC AGA TG5’-AAG GTA AAA CAT TTG TTAT5’-AAT CTG TCC CAC AGA TG5’-AAT CTG TCT CAC AGA TGADH2(等位基因1和等位基因3)5’-GCA GTA TCT GTA CCG TC5’-GCA GTA TCC GTA CCG TC5’-GCA GTA TCA GTA CCG TC5’-GCA GTA TCG GTA CCG TCALDH2 5’-CAT ACA CTG AAG TGA AA5’-CAT ACA CTA AAG TGA AA 5’-CAT ACA CTT AAG TGA AA5’-CAT ACA CTC AAG TGA AA乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片制备方法步骤为1)芯片载体的处理载波片用铬酸洗液浸泡过夜，水洗，24～26％氨水中过夜，水洗，玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节PH至4～4.5，95％乙醇超声清洗，150～160℃烘干3～5小时，9～11％戊二醛处理成醛基化；2)引物及探针的合成针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计了一套探针(如表1)，针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计合成了4对引物(如表2)，每对引物中各有一条Cyp-3信号分子标记，合成后用浓氨水75～85℃脱保护，切割14～17小时，OPC柱纯化，紫外定量后真空干燥浓缩，-20～-80℃保存备用；3)基因芯片制备及后处理寡核苷酸探针以15μM的浓度溶解在3×SSC溶液中，用PixySys5500芯片制备仪将寡核苷酸喷到醛基化的玻片上，点间距为0.5mm。点样完毕后，室温放置过夜。乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片用于酒精性肝病患者乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的多态性检测和分型。本专利技术将经过选择的探针点样于玻片上，分别与经PCR扩增的乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的DNA片段进行杂交，一次性获得各位点的多态情况，从而实现对乙醇代谢酶相关基因多态性进行快速、简捷、高通量检测和分型，具有重要的社会和经济效益。具体实施例方式本专利技术玻片上固相化的探针为寡核苷酸探针，其序列根据乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的基因特征设计，起长度范围在15-20个碱基，一般为18个碱基，其Tm值基本一致，在40～43℃。所说引物是根据乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的基因特征设计，引物序列长度在20-24个碱基之间，分别用于上述基因的扩增。信号分子标记是针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的基因序列扩增的引物。信号分子标记是荧光分子。表1乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的探针 表2乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的引物 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片，其特征在于：在载体上设有如下探针： ＡＤＨ３： ５’－ＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＴＡＴ ５’－ＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＴＴＡＴ ５’－ＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＡＡＴ ＴＴＧ ＴＴＡＴ ５’－ＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＴＧ ＴＴＡＴ ＡＤＨ２（等位基因１和等位基因２）：５’－ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＣＧ ＣＡＣ ＡＧＡ ＴＧ ５’－ＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＧ ＴＴＡＴ ５’－ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＡＣ ＡＧＡ ＴＧ ５’－ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＧＡ ＴＧ ＡＤＨ２（等位基因１和等位基因３）：５’－ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＴＡ ＣＣＧ ＴＣ ５’－ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＣＣ ＧＴＡ ＣＣＧ ＴＣ ５’－ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＣＡ ＧＴＡ ＣＣＧ ＴＣ ５’－ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＣＧ ＧＴＡ ＣＣＧ ＴＣ ＡＬＤＨ２： ５’－ＣＡＴ ＡＣＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＴＧＡ ＡＡ ５’－ＣＡＴ ＡＣＡ ＣＴＡ ＡＡＧ ＴＧＡ ＡＡ ５’－ＣＡＴ ＡＣＡ ＣＴＴ ＡＡＧ ＴＧＡ ＡＡ ５’－ＣＡＴ ＡＣＡ ＣＴＣ ＡＡＧ ＴＧＡ ＡＡ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：厉有名，虞朝辉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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