鉴别和检测水生生物传染病致病病毒的遗传标记以及使用其的致病病毒鉴别和检测方法技术

本发明专利技术涉及用于鉴别或检测水生生物传染病致病病毒的遗传标记以及使用该遗传标记的致病病毒鉴别或检测方法，更具体地涉及一种方法，该方法包含：选择和扩增用于编码病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、真鲷虹彩病毒(RSIV，真鲷虹彩病毒病的致病病毒)/传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、或锦鲤疱疹病毒(KHV)的特定基因的DNA碱基序列；然后杂交特异性识别扩增产物的肽核酸(PNA)；通过控制杂交产物的温度获得基于温度的熔解曲线；以及通过分析所获得的熔解曲线从熔解温度确定病毒类型，或检测鱼感染该病毒类型的状况。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】鉴别和检测水生生物传染病致病病毒的遗传标记以及使用其的致病病毒鉴别和检测方法
本专利技术涉及用于鉴别和检测引起传染性水生生物病害的病毒的遗传标记，以及使用其鉴别和检测所述病毒的方法。更具体而言，本专利技术涉及一种鉴别或检测引起传染性水生生物病害的病毒的方法，所述方法包含：选择并扩增编码病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、作为引起真鲷虹彩病毒病的病毒的真鲷虹彩病毒(RSIV)或传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、或锦鲤疱疹病毒(KHV)的特异性基因的DNA核苷酸序列；杂交特异性识别所述扩增产物的肽核酸(PNA)；控制所述杂交产物的温度以获得温度依赖性熔解曲线；以及通过分析所得到的熔解曲线来确定熔解温度，从而鉴别病毒类型或检测鱼是否会感染所述病毒类型。
技术介绍
在诊断传染性疾病的最新方法中，已经开发了基于分子诊断的诊断方法和试剂盒。在这些方法中，主要已使用的方法包含进行通用聚合酶链反应(PCR)以获得扩增产物，然后或者通过电泳分析扩增产物，或者通过实时PCR使用荧光探针或SYBR绿分析所述扩增。特别是，在传染性水生生物病害中，病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)/传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、或锦鲤疱疹病毒(KHV)被归类为国家法定报告传染病。为了检测这种病毒，根据世界动物卫生组织(OIE)的“水生动物卫生法典”中阐述的标准，进行常规PCR以获得扩增产物，通过电泳分析扩增产物，然后克隆扩增产物，并通过诸如Sanger测序之类的方法分析纯化的质粒DNA的核苷酸序列。因此，存在程序复杂和疾病诊断分析耗时的缺点。对于鱼病毒VHSV的分子诊断，已经开发了各种基因诊断技术，包括RT-PCR和实时RT-PCR，其能够在短时间内以高精确度和灵敏度进行诊断。对于VHSV诊断，根据OIE标准使用由一步或两步构成的常规RT-PCR方法。特别是，由于近来在北美、亚洲、欧洲和大西洋地区已经轮流发现了病毒的遗传性变型，所以已经对所述致病病毒的流行病动力学进行了研究，并且基于扩增产物测序的基因型分析已经越来越重要，其在根据OIE标准进行PCR后进行以求获得准确的分子诊断结果。近年来，已经开发了用于简单基因型分析的技术例如LAMP(环介导等温扩增)，但这些技术不被OIE推荐，因为在检测具有各种基因型的病毒时使存在限制。为了检测RSIV或ISKNV，它们是引起真鲷虹彩病毒病的病毒，使用基于组织涂片样品的染色技术和血清学诊断法，例如基于MAb的IFAT。对于分子诊断，根据OIE标准使用两种引物进行常规PCR。OIE推荐的诊断方法是诊断真鲷虹彩病毒病(RSIVD)的方法。其中，使用“OIE方案1(OIE1)”PCR方法有可能诊断真鲷虹彩病毒病但区分不了RSIV和ISKNV，而使用“OIE方案2(OIE4)”PCR方法有可能通过仅特异性扩增RSIV而不扩增ISKNV来区分RSIV和ISKNV，它们都是引起真鲷虹彩病毒病的病毒。因此，缺点在于，为了诊断真鲷虹彩病毒病和为了准确鉴定引起该疾病的病毒，应该进行根据OIE标准的两种常规PCR步骤。为了锦鲤疱疹病毒(KHV)的分子诊断，进行在多种公开的PCR方法中发现对于KHV诊断最灵敏的两种常规PCR方法(OIE，2014)。第一种方法是使用由Bercovier等在2005年开发的“BercovierTK引物”的方法，第二种方法是由Yuasa等开发的方法(GraySph引物/Yuasa修饰)。尽管在许多诊断实验室中经常进行比常规PCR方法具有更高灵敏度的诸如实时PCR之类的诊断方法，但为了避免在样品制备和PCR过程期间的污染，上述两种PCR方法是最经常进行的。目前，对于国家法定报告传染病的诊断和鉴定，常规PCR方法被用作国家推荐的标准诊断方法。根据OIE标准通过电泳分析PCR扩增产物不能客观地完成(灰色区域)，或者进行验证步骤，其包括使用克隆载体克隆微弱的PCR扩增产物，然后通过测序再次确认扩增产物的核苷酸序列。这种验证步骤通过分析非特异性PCR带的序列来进行，并且存在分析程序复杂且耗时的问题。特别是当常规PCR(在通过测序进行确定之前)指示扩增产物是阳性时，该扩增产物被认为具有引起水生生物传染性疾病的风险，并因此采取预防措施。然而，当后来进行的测序表明PCR结果是假阳性时，可能降低检测实验室的可信度，也可能发生对渔业合作社的损害。为此，迫切需要以快速和准确的方式诊断国家法定报告传染病的改进方法。在这种技术背景下，本专利技术人做了大量工作来开发一种鉴别鱼病致病病毒的方法，所述方法通过不进行测序步骤或在进行测序步骤之前，确定用于鉴别或检测引起传染性水生生物病害的病毒VHSV、RSIV/ISKNV或KHV的PCR产物是否将被特异性/非特异性地扩增，而且所述方法检测感染有所述致病病毒的个体(例如鱼)。结果是，本专利技术人鉴定了用于鉴别和/或检测鱼病致病病毒VHSV、RSIV/ISKNV或KHV类型的遗传标记，并且已经发现，当使用所述遗传标记特异性的肽核酸引物来获得取决于病毒类型而具有不同荧光强度的扩增和熔解曲线时，可以简单、快速和准确的方式鉴别鱼病致病病毒，从而完成本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于鉴别或检测引起传染性水生生物病害的病毒VHSV、RSIV/ISKNV或KHV的遗传标记、引物和PNA探针。本专利技术的另一个目的是提供一种用于鉴别或检测VHSV、RSIV/ISKNV或KHV的组合物和试剂盒，其包含上述引物和上述PNA探针。本专利技术的另一个目的是提供一种方法，其包含：使用上述引物产生单链遗传标记序列片段；将上述PNA探针与所产生的遗传标记序列片段杂交；以及获得由所述PNA探针杂交产生的Tm值，从而确定VHSV、RSIV/ISKNV或KHV的类型，或检测个体是否将会感染所述鱼病致病病毒。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种用于鉴别或检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的遗传标记，所述病毒是引起传染性水生生物病害的病毒，其中所述遗传标记由序列号11的核苷酸序列表示。本专利技术还提供了一种用于鉴别或检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的遗传标记，所述病毒是引起传染性水生生物病害的病毒，其中所述遗传标记由序列号14或序列号15的核苷酸序列表示。本专利技术还提供了一种用于鉴别或检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的引物，所述病毒是引起传染性水生生物病害的病毒，其中所述引物由序列号6的核苷酸序列表示。本专利技术还提供了一种用于鉴别或检测真鲷虹彩病毒(RSIV)或传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的引物，所述病毒是引起传染性水生生物病害的病毒，其中所述引物由序列号7的核苷酸序列表示。本专利技术还提供了一种用于鉴别或检测真鲷虹彩病毒(RSIV)的引物，所述病毒是引起传染性水生生物病害的病毒，其中所述引物由序列号8的核苷酸序列表示。本专利技术还提供了一种用于鉴别或检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的引物，所述病毒是引起传染性水生生物病害的病毒，其中所述引物由序列号9或序列号10的核苷酸序列表示。本专利技术还提供了一种用于鉴别或检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的PNA探针，所述病毒是引起传染性水生生物病害的病毒，其中所述PNA探针由序列号1的核苷酸序列表示。本专利技术还提供了一种用于鉴别或检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的PN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别或检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的遗传标记，所述病毒是引起传染性水生生物病害的病毒，其中，所述遗传标记由序列号11的核苷酸序列表示。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.15 KR 10-2016-00056111.一种用于鉴别或检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的遗传标记，所述病毒是引起传染性水生生物病害的病毒，其中，所述遗传标记由序列号11的核苷酸序列表示。2.一种用于鉴别或检测真鲷虹彩病毒(RSIV)的遗传标记，其由序列号13的核苷酸序列表示。3.一种用于鉴别或检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的遗传标记，其由序列号14或序列号15的核苷酸序列表示。4.一种用于鉴别或检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的PNA探针，其由序列号1的核苷酸序列表示。5.根据权利要求4所述的PNA探针，其中，所述PNA探针包含与其连接的任何一种或多种报道分子和猝灭剂。6.一种用于鉴别或检测真鲷虹彩病毒(RSIV)的PNA探针，其由序列号3的核苷酸序列表示。7.根据权利要求6所述的PNA探针，其中，所述PNA探针包含与其连接的任何一种或多种报道分子和猝灭剂。8.一种用于鉴别或检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的PNA探针，所述病毒是引起传染性水生生物病害的病毒，其中，所述PNA探针由序列号4或序列号5的核苷酸序列表示。9.根据权利要求8所述的PNA探针，其中，所述PNA探针包含与其连接的任何一种或多种报道分子和猝灭剂。10.一种用于鉴别或检测引起传染性水生生物病害的病毒的组合物，所述组合物包含：任何一种或多种选自由序列号6至序列号10的核苷酸序列表示的引物中的引物；以及由序列号1、序列号3、序列号4或序列号5的核苷酸序列表示的PNA探针。11.一种用于鉴别或检测引起传染性水生生物病害的病毒的试剂盒，所述试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵眉英，朴明爱，池宝荣，黄晟敦，
申请(专利权)人：大韩民国国立水产科学院，
类型：发明
国别省市：韩国,KR