用于植物中的特异性核酸编辑的方法和构建体技术

本发明专利技术涉及靶向修饰植物靶结构中的核酸靶区域的方法和构建体。本发明专利技术特别涉及直接获得植物或者植物材料的方法和构建体，所述植物或植物材料包含以靶向方式引入分生组织细胞中的核酸编辑。混合物可以瞬时和/或稳定方式引入。本发明专利技术还涉及新的植物优化引入策略。本发明专利技术进一步涉及进行体外筛选试验以在体外对合适的gRNA候选物就其效力进行初查。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于植物中的特异性核酸编辑的方法和构建体
本专利技术特别涉及制备植物、植物材料或者植物细胞的方法，包括提供至少一个gRNA以及CRISPR核酸酶或其催化活性片段和/或效应子结构域，或者至少一个重组构建体，并将其引入包含至少一个分生组织细胞的靶植物结构中，所述重组构建体包含gRNA以及CRISPR核酸酶或催化活性片段和/或效应子结构域或其编码序列，以及至少一个调节序列和/或定位序列，基于此，可以直接获得在靶区域中包含靶向修饰的核酸的植物、植物材料或者植物细胞，其中所述至少一个重组构建体优选不是染色体或者染色体外整合的。另外，公开了合适的重组构建体和载体以及将这些构建体和载体引入靶植物结构中的方法。最后，公开了重组构建体用于特异性修饰植物细胞中的靶核酸区域的用途，以及根据本专利技术方法可以获得或者获得的植物、植物材料或植物细胞。此外，公开了一种体外筛选方法作为初步检测，以容易地高通量确定gRNA或gRNA编码序列(与CRISPR核酸酶包括Cas和/或Cpf1核酸酶或者其变体或其催化活性片段一起)对于靶向修饰植物细胞中特定核酸靶区域的功能性。本文公开的方法特别适于靶向引入、修饰或者消除植物中希望的性状，特别是在靶向性状开发的框架中，以确保高度特异性和有效编辑。专利技术背景基因组编辑是一种分子生物学方法，通过基因组编辑可以将特异性修饰如插入、缺失或者点突变或者其组合引入活生物体的基因组中。为此，需要特定的分子工具，首先所述分子工具具有核酸酶活性，但是最重要的是其可以以足够的特异性被引导至待修饰的靶序列，以规划和进行特异性的定点诱变。在过去的几年中，在植物生物技术领域，特异性基因组编辑已经发展成为常规的培育和转基因策略的替代方式。然而，目前可用的工具，如锌指核酸酶(ZFN)或者“转录激活子样效应子核酸酶”(TALEN)仅有限程度地用于植物生物技术，这是因为偶发的低效及也因为构建体复杂及设计昂贵。近年来已经广泛使用的用于精确及定点基因组修饰的进一步的分子工具是基于CRISPR核酸酶的系统。这些核酸酶包括尤其是Cas(CRISPR相关基因)核酸酶或者Cpf1核酸酶，组成了在文献中描述为“CRISPR”系统(规律成簇的间隔短回文重复序列)的一部分。这个系统最初在1987年鉴定，当分析大肠杆菌(E.coli)的iap基因时，鉴定了在细菌基因组中天然存在的重复序列。后来发现这些20-50个核苷酸的回文DNA重复序列遵循一个模式。然后采用了首字母缩写CRISPR(Jansen,R.etal,“IdentificationofgenesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes”,Mol.Microbiol.,2002,43(6),1565-1575)，基于此，研究更密切的聚焦于细菌。最后，有报道CRISPR基因座构成一种细菌免疫系统类型，且可以赋予针对噬菌体的免疫性(Barrangouetal“CRISPRprovidesacquiredresistanceagainstvirusesinprokaryotes”Science2007,315:1709.1712)，其中侵入的噬菌体DNA首先作为前间区序列安装进CRISPR基因座，然后该基因座转录并最后激活CRISPR介导的沉默机制。功能特性逐步导致该系统被用作高等生物体的基因组修饰的通用工具。同时，描述了大量CRISPR/Cas系统(见例如VanderOostetal“UnravellingthestructuralandmechanisticbasisofCRISPR-Cassystems“Nature2014,482:331-338,Makarovaetal.,AnupdatedevolutionaryclassificationofCRISPR-Cassystems“,NatureReviewsMicrobiology13,722–736)；迄今为止分析仍远未完成。由于细菌II型CRISPR系统的揭示和利用，目前可以使用具有巨大潜力的进一步的基因组编辑系统。迄今已经描述了5种类型(I-V)的CRISPR系统(Barrangouetal.,2007,Science,315(5819):1709-12；Bounsetal.,2008,Science,321(5891):960-4；MarraffiniandSontheimer,2008,Science,322(5909):1843-5；Makarovaetal.,NatureRev.Microbiol.,13,722-736,2015)，其中每个系统均包含一簇CRISPR相关基因(Cas或者其它基因)及属于其的CRISPR阵列。这些特征性CRISPR阵列由重复序列(直接重复，所谓重复序列(repeat))组成，其中嵌入非重复序列的短区段(间隔序列)，其中间隔序列源自外源遗传物质的短片段(前间区序列)。随后将CRISPR阵列转录为短CRISPRRNA(crRNA)，其中crRNA将CRISPR系统的Cas蛋白或者其它效应子核酸酶指引至各自的靶核酸分子，其中裂解是通过Watson-Crick碱基配对发生。I型和III型CRISPR系统使用Cas蛋白与crRNAs的复合物以识别及随后裂解靶核酸(Wiedenheftetal.,2011,Nature,477(7365):486-9)。不同的是，II型CRISPR系统以其天然形式识别和裂解，其靶DNA与RNA指导的核酸酶Cas9及两个非编码RNA(crRNA和反式激活RNA(tracrRNA))相互作用(Garneauetal.,2010；Sapranauskasetal.,2011,NucleicAcidsRes.,39(21)；9275-82；Deltchevaetal.,2011,Nature,471(7340)；602-7)。也已经提议了一种可能的IV型CRISPR系统(Makarovaetal.,Biol.Direct,6(38),2011)。在天然系统中由CRISPR/Cas介导的免疫应答需要CRISPR-RNA(crRNA)，其中这种控制Cas核酸酶特异性激活的指导RNA的成熟在迄今已经鉴定的不同CRISPR系统之间显著不同。首先，也称作间隔序列的侵入DNA被整合在CRISPR基因座的近端的两个相邻重复区域之间。II型CRISPR系统编码Cas9核酸酶作为在干扰步骤中关键酶，其含有crRNA及反式激活RNA(tracrRNA)作为指导基序。这些杂交并形成双链(ds)RNA区域，其由RNAseIII识别且可以裂解以形成成熟的crRNA。然后将这些与Cas分子相关联以将核酸酶特异性定向于靶核酸区域。重组CRISPR/Cas系统或者一般而言，CRISPR/核酸酶系统通过小的单独剪裁的非编码RNA(指导RNA或者gRNA)组合可能修饰的核酸酶使得可以进行靶向的DNA识别和/或结合，及任选存在的单链或双链断裂的产生。重组gRNA分子可包含可变DNA识别区及核酸酶相互作用区，及因此可以特别设计，不依赖于特异性靶核酸和希望的核酸酶(Jineket.al.,2012,supra)。作为进一步的安全性机制，PAM(前间区序列邻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生植物、植物材料或者植物细胞的方法，包括如下步骤：(i)提供靶植物结构，其包含至少一个分生组织细胞，其中所述至少一个分生组织细胞包含至少一个靶核酸区域；(ii)提供至少一个gRNA或者提供一或多个重组构建体，其中所述重组构建体包含：(a)至少一个gRNA或者编码gRNA的序列，及(b)任选存在的至少一个调节序列和/或定位序列，及(c)任选存在的至少一个DNA修复基质，及提供至少一种CRISPR核酸酶，优选Cas核酸酶或者Cpf1核酸酶或者其催化活性片段和/或效应子结构域，或者提供一或多个重组构建体，其中重组构建体包含：(a)至少一个CRISPR核酸酶或者其催化活性片段或者编码CRISPR核酸酶或其催化活性片段的序列，和/或至少一个效应子结构域或者编码效应子结构域的序列，及(b)任选存在的至少一个调节序列和/或定位序列，其中所述gRNA能与所述靶核酸区域的区段杂交，也能与CRISPR核酸酶或其催化活性部分和/或效应子结构域相互作用；其中，当所述gRNA或者编码gRNA的序列，及CRISPR核酸酶或其催化活性片段或者编码CRISPR核酸酶或其催化活性片段的序列，和/或效应子结构域或者编码效应子结构域的序列由一或多个重组构建体提供时，所述gRNA或者编码gRNA的序列及CRISPR核酸酶或其催化活性片段或者编码CRISPR核酸酶或其催化活性片段的序列和/或效应子结构域或者编码效应子结构域的序列位于相同或者不同的重组构建体之上或之中；(iii)将所述gRNA、CRISPR核酸酶或其催化活性片段和/或效应子结构域和/或重组构建体引入所述靶植物结构中；(iv)在允许所引入的gRNA、CRISPR核酸酶或其催化活性片段和/或效应子结构域和/或所引入的重组构建体激活，从而特异性修饰靶植物结构中的靶核酸区域的条件下培养所述靶植物结构，以获得包含至少一个分生组织细胞的靶植物结构，所述分生组织细胞包含靶核酸区域的特异性修饰；(v)从特异性修饰的至少一个分生组织细胞获得植物、植物材料或者植物细胞；其中通过细胞分裂和分化及任选存在的异花授粉或者自花授粉从特异性修饰的至少一个分生组织细胞直接获得所述植物、植物材料或者植物细胞，及其中所获得的植物、获得的植物材料或者获得的植物细胞包含靶核酸区域的特异性修饰。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.19 DE 102015006335.9;2015.11.05 DE 10201501.一种产生植物、植物材料或者植物细胞的方法，包括如下步骤：(i)提供靶植物结构，其包含至少一个分生组织细胞，其中所述至少一个分生组织细胞包含至少一个靶核酸区域；(ii)提供至少一个gRNA或者提供一或多个重组构建体，其中所述重组构建体包含：(a)至少一个gRNA或者编码gRNA的序列，及(b)任选存在的至少一个调节序列和/或定位序列，及(c)任选存在的至少一个DNA修复基质，及提供至少一种CRISPR核酸酶，优选Cas核酸酶或者Cpf1核酸酶或者其催化活性片段和/或效应子结构域，或者提供一或多个重组构建体，其中重组构建体包含：(a)至少一个CRISPR核酸酶或者其催化活性片段或者编码CRISPR核酸酶或其催化活性片段的序列，和/或至少一个效应子结构域或者编码效应子结构域的序列，及(b)任选存在的至少一个调节序列和/或定位序列，其中所述gRNA能与所述靶核酸区域的区段杂交，也能与CRISPR核酸酶或其催化活性部分和/或效应子结构域相互作用；其中，当所述gRNA或者编码gRNA的序列，及CRISPR核酸酶或其催化活性片段或者编码CRISPR核酸酶或其催化活性片段的序列，和/或效应子结构域或者编码效应子结构域的序列由一或多个重组构建体提供时，所述gRNA或者编码gRNA的序列及CRISPR核酸酶或其催化活性片段或者编码CRISPR核酸酶或其催化活性片段的序列和/或效应子结构域或者编码效应子结构域的序列位于相同或者不同的重组构建体之上或之中；(iii)将所述gRNA、CRISPR核酸酶或其催化活性片段和/或效应子结构域和/或重组构建体引入所述靶植物结构中；(iv)在允许所引入的gRNA、CRISPR核酸酶或其催化活性片段和/或效应子结构域和/或所引入的重组构建体激活，从而特异性修饰靶植物结构中的靶核酸区域的条件下培养所述靶植物结构，以获得包含至少一个分生组织细胞的靶植物结构，所述分生组织细胞包含靶核酸区域的特异性修饰；(v)从特异性修饰的至少一个分生组织细胞获得植物、植物材料或者植物细胞；其中通过细胞分裂和分化及任选存在的异花授粉或者自花授粉从特异性修饰的至少一个分生组织细胞直接获得所述植物、植物材料或者植物细胞，及其中所获得的植物、获得的植物材料或者获得的植物细胞包含靶核酸区域的特异性修饰。2.权利要求1的方法，其中在步骤(v)的植物、植物材料或者植物细胞中，所述重组构建体不是染色体或者染色体外整合的，所述重组构建体：(a)包含至少一个gRNA或者编码gRNA的序列，或者(b)包含至少一个CRISPR核酸酶，优选Cas核酸酶或者Cpf1核酸酶或者其催化活性片段，或者编码CRISPR核酸酶或其催化活性部分的序列和/或至少一个效应子结构域或者编码效应子结构域的序列。3.权利要求1或2的方法，其中在步骤(ii)中，使所述gRNA或者编码gRNA的序列，和/或CRISPR核酸酶，优选Cas核酸酶或Cpf1核酸酶，或其催化活性片段或者编码CRISPR核酸酶或其催化活性片段的序列，和/或效应子结构域或者编码效应子结构域的序列适合在植物细胞中应用。4.权利要求1-3之一的方法，其中在步骤(ii)与(iii)之间提供用于引入所述重组构建体的至少一个载体。5.前述权利要求之一的方法，其中在步骤(ii)与(iii)之间提供包含重组核酸片段的至少一个另外的重组构建体，其用于特异性同源定向修复靶植物结构中的靶核酸区域或者插入至靶植物结构中的靶核酸区域，及任选存在的至少一个另外的载体以引入所述至少一个另外的重组构建体。6.前述权利要求之一的方法，其中所述分生组织细胞是包含至少一个分生组织细胞或者分生组织的植物胚或幼苗或植物的成熟或者不成熟植物细胞。7.权利要求1或2的方法，其中所述分生组织细胞是单子叶或者双子叶植物的细胞。8.前述权利要求之一的方法，其中至少一个载体选自农杆菌(Agrobacterium...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·哈林，S·马丁奥蒂戈萨，M·尼森，C·施特赖内尔，N·舒曼，E·扬戴克，
申请(专利权)人：KWS种子欧洲股份公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE