产生RNA测序文库的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备链特异性RNA测序文库的新方法，该文库可用于鉴定转录为RNA的DNA编码和非编码链。这种链特异性RNA测序文库特别适用于发现反义RNA和非编码RNA。与阻断连接的部分共价偶联的随机引物寡核苷酸被用于RT反应或随后的第二DNA链的产生，使得所产生的双链DNA的仅一条链在5’核苷酸处连接至测序衔接子并通过配对末端测序法进行测序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生RNA测序文库的方法
本专利技术涉及一种制备链特异性RNA测序文库的新方法，该文库可用于鉴定转录为RNA的DNA编码和非编码链。这种链特异性RNA测序文库特别适用于发现反义RNA和非编码RNA。与阻断连接的部分共价偶联的随机引物寡核苷酸被用于RT反应或随后的第二DNA链的产生，使得所产生的双链DNA的仅一条链在5’核苷酸处连接至测序衔接子并通过配对末端测序法进行测序。
技术介绍
除了覆盖高等真核生物基因组的1.5％的mRNA之外，已经鉴定到了许多具有广泛变化的表达水平的非编码RNA。这些新型转录物的生物学功能在很大程度上是未知的并代表了一个新的研究领域，需要高通量的转录组研究来阐明生物过程。下一代测序领域中近期的发展使得高通量RNA测序(RNA-Seq)技术成为可能，其已成为分析基因表达谱、检测转录物变体以及理解非编码调控RNA功能的有力工具。通过将测序衔接子连接到双链DNA产生标准的RNA-Seq文库。有两种主要的制备链特异性RNA-Seq文库的方法。第一种方法包括将不同的衔接子连接到RNA分子的3’和5’端(参见例如生命技术(LifeTechnologies)的离子全RNA-Seq试剂盒第二版(IonTotalRNA-SeqKitv2))。另一种更广泛使用的方法包括在第二链DNA合成中除了dNTP之外还并入dUTP。衔接子连接后，所述第二链DNA可被尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)特异性消化，从而只有包含第一链cDNA的文库链将被测序，由此可获得关于转录物方向的信息(参见M.Sultan等，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications422(2012)643-646)。但是，这些常规方法有其缺点。所述第一种方法受到RNA的偏倚连接的影响，这是由RNA底物和用于连接的衔接子之内和之间的结构性质引起的。更广泛使用的在第二链DNA合成中除了dNTP之外还使用dUTP的方法，需要在衔接子连接之后进行额外的UNG消化步骤，使得文库构建过程更为复杂和耗时。另外，就像任何酶促反应一样，所述UNG反应不是100％有效的。即使在UNG消化之后仍可能留有残留的第二链cDNA，可以导致RNA测序数据的错误解释。因此，本领域需要更简单和更具体的RNA序列分析方法。
技术实现思路
有关转录RNA的确切链的信息对于发现反义和非编码RNA种类以及研究其功能是有用的。区分正义转录物和重叠反义转录物的能力还可以进一步提高RNA定量的准确性。在这个背景下，我们开发了一种新的RNA测序方法，它对于扩增单链模板以及多个这样的链是高度特异的，并且与目前最广泛使用的上述RNA测序方法相反，是高度特异性的且不需要额外的酶促步骤来实现单个测序模板的扩增。特别地，本专利技术涉及RNA测序的方法，其中所述方法包括：(i)提供RNA；(ii)通过使用逆转录酶、第一组寡核苷酸引物以及步骤(i)的RNA对所述RNA进行逆转录，产生与所述RNA互补的一条或多条单链第一DNA链(cDNA)；以及(iii)通过使用DNA聚合酶、第二组寡核苷酸引物以及(ii)的单链cDNA，产生第二DNA链，其中，a)所述第一组寡核苷酸引物包含在其5’端核苷酸处的共价偶联部分，该部分阻断在所产生的第一DNA链的5’端处的连接；或者b)所述第二组寡核苷酸引物包含在其5’端核苷酸处的共价偶联部分，该部分阻断在所产生的第二DNA链的5’端处的连接。在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：(iv)任选地使用多核苷酸激酶以及具有聚合酶和核酸外切酶活性的酶对双链DNA链进行末端修复以获得末端修复的DNA链；(v)任选地使用脱氧核苷酸转移酶向所述DNA链的3’端添加末端腺嘌呤；以及(vi)将任选地包含末端胸腺嘧啶的衔接子连接到任选地包含3'端腺嘌呤的DNA链。所述方法可进一步包括所生成的DNA的序列分析。在一些实施方式中，所述方法包括；(i)提供RNA；(ii)通过使用逆转录酶、第一组寡核苷酸引物以及步骤(i)中的RNA对所述RNA进行逆转录，产生与所述RNA互补的一条或多条单链第一DNA链(cDNA)；(iii)通过使用DNA聚合酶、第二组寡核苷酸引物以及步骤(ii)的单链cDNA，产生第二DNA链；(iv)将衔接子连接至步骤(iii)的双链DNA；以及(v)对所产生的DNA进行测序，其中，a)所述第一组寡核苷酸引物包含在其5’端核苷酸处的共价偶联部分，该部分阻断在所产生的第一DNA链的5’端处的连接；或者b)所述第二组寡核苷酸引物包含在其5’端核苷酸处的共价偶联部分，该部分阻断在所产生的第二DNA链的5’端处的连接。通过产生所述第二DNA链，产生双链DNA。在上述方法的一些实施方式中，在步骤(iv)之前，该方法包括以下步骤：(iii)(a)使用多核苷酸激酶以及具有聚合酶和核酸外切酶活性的酶对双链DNA链进行末端修复以获得末端修复的DNA链。在一些实施方式中，步骤(iii)(a)后面是步骤(iii)(b)，其包括使用脱氧核苷酸转移酶向所述DNA链的3’端添加末端腺嘌呤，其中所述衔接子包含3’端胸腺嘧啶，其在步骤(iv)中与包含3’端腺嘌呤的所述DNA链连接。在一些实施方式中，所述共价偶联至阻断部分的寡核苷酸引物和/或未修饰的寡核苷酸引物为随机寡核苷酸引物。在一些实施方式中，所述方法包括提取和任选的富集感兴趣的RNA的初始步骤。在一些实施方式中，提取的RNA被片段化成19-510bp的平均大小。在上述方法的一些实施方式中，可以将分子连接到固体支持物上进行配对末端测序。本专利技术的另一个方面涉及一种试剂盒，其中所述试剂盒包含：(i)包含与5’端核苷酸共价偶联的部分的寡核苷酸引物，所述部分阻断DNA与测序衔接子的连接；(ii)未修饰的寡核苷酸引物；(iii)逆转录酶；以及(iv)任选的DNA聚合酶；在一些实施方式中，所述试剂盒包括：(i)包含与5’端核苷酸共价偶联的部分的寡核苷酸引物，所述部分阻断DNA与测序衔接子的连接；(ii)未修饰的寡核苷酸引物；(iii)逆转录酶；(iv)任选的DNA聚合酶；(v)多核苷酸激酶以及具有聚合酶和核酸外切酶活性的酶；(vi)任选的脱氧核苷酸转移酶；(vii)两种衔接子，其任选地包含末端胸腺嘧啶，所述衔接子各自分别与表面结合(surface-bound)的扩增引物互补；以及(viii)连接酶。在上述试剂盒的一些实施方式中，所述共价偶联至阻断部分的寡核苷酸引物或未修饰的寡核苷酸引物为随机寡核苷酸引物。在上述方法或试剂盒的一些是实施方式中，所述逆转录酶选自下列中的任一项：逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、乙型肝炎逆转录酶、花椰菜花叶病毒逆转录酶、鼠白血病病毒逆转录酶、禽成髓细胞性白血病病毒(AMV)、细菌逆转录酶、TthDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、TneDNA聚合酶、TmaDNA聚合酶及其酶活性突变体、片段、变体和/或衍生物。在一些实施方式中，“阻断连接的部分”或“阻断部分”是指多于一个原子的较大分子的特定部分，在本文中是经修饰的寡核苷酸的部分，其共价偶联至经修饰的引物寡核苷酸的5’核苷酸。所述部分优选阻断该部分所在位点处，优选在寡核苷酸5’端的5’端核苷酸处的任何连接。在上述方法或试剂盒的一些实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNA测序方法，其中所述方法包括：(i)提供RNA；(ii)通过使用逆转录酶、第一组寡核苷酸引物以及步骤(i)的RNA对所述RNA进行逆转录，产生与所述RNA互补的一条或多条单链第一DNA链(cDNA)；(iii)通过使用DNA聚合酶、第二组寡核苷酸引物以及(ii)的单链cDNA，产生第二DNA链；(iv)将衔接子连接至步骤(iii)的双链DNA；以及(v)对所述产生的DNA进行测序，其中，a)所述第一组寡核苷酸引物包含在其5’端核苷酸处的部分，所述部分阻断在所产生的第一DNA链的5’端处的连接；或者b)所述第二组寡核苷酸引物包含在其5’端核苷酸处的部分，所述部分阻断在所产生的第二DNA链的5’端处的连接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.24 EP 15182234.31.一种RNA测序方法，其中所述方法包括：(i)提供RNA；(ii)通过使用逆转录酶、第一组寡核苷酸引物以及步骤(i)的RNA对所述RNA进行逆转录，产生与所述RNA互补的一条或多条单链第一DNA链(cDNA)；(iii)通过使用DNA聚合酶、第二组寡核苷酸引物以及(ii)的单链cDNA，产生第二DNA链；(iv)将衔接子连接至步骤(iii)的双链DNA；以及(v)对所述产生的DNA进行测序，其中，a)所述第一组寡核苷酸引物包含在其5’端核苷酸处的部分，所述部分阻断在所产生的第一DNA链的5’端处的连接；或者b)所述第二组寡核苷酸引物包含在其5’端核苷酸处的部分，所述部分阻断在所产生的第二DNA链的5’端处的连接。2.权利要求1所述的方法，其中在步骤(iv)之前，所述方法包括步骤：(iii)(a)使用多核苷酸激酶以及具有聚合酶和核酸外切酶活性的酶对双链DNA链进行末端修复以获得末端修复的DNA链。3.权利要求2所述的方法，其中步骤(iii)(a)后面是步骤(iii)(b)，其包括使用脱氧核苷酸转移酶向所述DNA链的3’端添加末端腺嘌呤，其中所述衔接子包含3’端胸腺嘧啶，其在步骤(iv)中与包含3’端腺嘌呤的所述DNA链连接。4.一种试剂盒，其包括：(i)包含与5’端核苷酸共价偶联的部分的寡核苷酸引物，所述部分阻断DNA与测序衔接子的连接；(ii)未修饰的寡核苷酸引物；(iii)逆转录酶；(iv)任选的DNA聚合酶；(v)多核苷酸激酶以及具有聚合酶和核酸外切酶活性的酶；(vi)任选的脱氧核苷酸转移酶；(vii)两种衔接子，其任选地包含末端胸腺嘧啶，所述衔接子各自分别与表面结合的扩增引物互补；以及(viii)连接酶。5.权利要求1-3中任一项所述的方法或权利要求4所述的试剂盒，其中包含阻断连接的部分的寡核苷酸引物和/或未修饰的寡核苷酸引物为随机寡核苷酸引物。6.权利要求1-3中任一项所述的方法或者权利要求4或5所述的试剂盒，其中所述逆转录酶选自逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、乙型肝炎逆转录酶、花椰菜花叶病毒逆转录酶、鼠白血病病毒逆转录酶、禽成髓细胞性白血病病毒(AMV)、细菌逆转录酶、TthDNA聚合酶或TaqDNA聚合酶中的任一者。7.权利要求1-3和...

【专利技术属性】
技术研发人员：方南，伯恩哈德·诺尔，卡特娅·海茨，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE