单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法技术

技术编号:1757009 阅读:317 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术是单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法,一、外周血淋巴细胞(PBL)的提取,二、外周血淋巴细胞总RNA的鉴定,三、优化后的聚合酶链反应(PCR)扩增体系,四、扩增产物的电泳扫描及序列分析,五、荧光定量检测。采用本发明专利技术检测方法,检测结果是用1-2%琼脂糖凝胶电泳,正常人在287bp处可见明显亮带,免疫力低的人群则明显减弱或缺失,以此结果,可以判断是否是肿瘤患者,若是肿瘤患者筛选生物治疗的药物或治疗方法,可以提高肿瘤患者针对性的治疗效果,对尚未有临床症状的人群,提供应当增强免疫力的警示,对研究人员可以提供寻求提高细胞免疫力的中草药等。本发明专利技术可以普遍应用于健康查体。(*该技术在2024年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学、免疫学检测领域,具体说是一种单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法
技术介绍
通过检测人外周血单个核细胞,所含HLA-I特异核糖核酸的含量,用以评估人体的免疫力高低的方法,在临床常用的CD4+/CD8+比值,它的敏感性和特异性均不能满足临床需求,近几年发展的流式细胞术,测定HLA-I蛋白,影响因素较多,其评估值较难真实反映其客观性。其它LDH释放试验、MTT试验也不适合于临床上的监测。为此,国际上曾开展过有关细胞免疫标志性指标的讨论,至今仍无法定论。
技术实现思路
本专利技术目的是,提供一种单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法,通过其检测结果评估人体的免疫力,提高肿瘤的诊治水平,依此筛选对肿瘤患者生物治疗的药物或方法等,对尚未有临床症状的人群,寻求提高细胞免疫力的中草药等。本专利技术为了完成专利技术目的,提供以下技术方案首先抽取外周血,提取淋巴细胞(PBL),然后对淋巴细胞总RNA进行鉴定,当可见5s,18s,28s,三条清晰条带时,可用于逆转录聚合酶链反应,使逆转录聚合酶链反应体系为25ul,其中逆转录酶1ul,随机引物1ul,Taq酶0.2ul,上下游引物各是0.4ul,其中HLA-B和HLA-A引物均是4对,使用其中任何一对均可,其中RNA是10ul,得出多聚酶链反应参数是42℃30min,95℃3min,94℃1min,55℃1min,72℃1min,5个循环,94℃10sec,60℃40sec,40个循环,72℃5min,对扩增产物电泳扫描及序列分析,最后进行荧光定量检测,即以引物为基础合成荧光探针,建立荧光定量逆转录聚合酶链反应,获得检测结果。HLA-B引物是上游引物5′-CAC ACT GAC CTG GCA GCG GGAT-3′,下游引物5′-AGA GCC CTG GGCACT GTC GCT-3′。上游引物5′-GGG CAG CTG TGG TGC CT-3′,下游引物是5′-CACTGT CGC TGC ACG CAG CCT-3′。HLA-B引物是上游引物5′-CTG CCG AAG CCCCTC ACC CTCT-3′,下游引物是5′-AGG ACC AGA CCC AGG ACA-3′。HLA-B引物是上游引物5′-GCC GTC TTC CCA GTC CAC CGT-3′,下游引物是5′-ATG CCCACG ATG GGG ACG GT-3′。HLA-A引物是上游引物5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′,下游引物5′-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3′。HLA-A引物是上游引物5′-ATGAGGCGGAGCAGTTGA-3′,下游引物5′-ATGGTGGGCTGGGAAGAC-3′。HLA-A引物是上游引物5′-GAGGCGGAGCAGTTGAGA-3′,下游引物5′-GGAAGGGCAGGAACAACTC-3′。HLA-A引物是上游引物5′-GGAGGACCAGACCCAGGACA-3′,下游引物5’-ATGGTGGGCTGGGAAGAC-3’。本专利技术所述的引物,其中HLA-B有一对最佳引物,即上游引物5′-CAC ACT GAC CTG GCA GCG GGAT-3′,下游引物5′-AGA GCCCTG GGC ACT GTC GCT-3′。HLA-A有一对最佳引物,即HLA-A引物是上游引物5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′,下游引物5′-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3′。其它各对引物均可达到本专利技术所述的检测结果。本专利技术通过研究、临床及试验得出单个核细胞的HLA-A和HLA-B是个很好的评估细胞免疫力的指标,肿瘤病人敏感性和特异性均为80%以上,远高于其他指标。采用本专利技术检测方法,检测结果是用1-2%琼脂糖凝胶电泳,正常人在287bp处可见明显亮带,免疫力低的人群则明显减弱或缺失,以此结果,可以判断是否是肿瘤患者,若是肿瘤患者筛选生物治疗的药物或治疗方法,可以提高肿瘤患者针对性的治疗效果,对尚未有临床症状的人群,提供应当增强免疫力的警示,对研究人员可以提供寻求提高细胞免疫力的中草药等。本专利技术可以普遍应用于健康查体。具体实施例方式一、外周血淋巴细胞(PBL)的提取1.一次性注射器无菌抽取2ml外周血于含有EDTA-K2抗凝剂的无菌试管中。2.4小时内分离血浆,3000r/min离心5分钟(普通离心机),以无菌吸管吸取白细胞层,加入盛有2ml生理盐水的无菌管中稀释,沿管壁缓慢加入盛有2ml淋巴细胞分离液的无菌管中(所有器材预先均用DEPC水处理)。3.3000r/min离心(普通离心机)25分钟,以无菌吸管小心吸取单个核细胞层至一灭菌EP管中,3500r/min离心(普通离心机)4分钟,吸弃上清液。4.加入0.5ml红细胞裂解液溶解其中少量残余红细胞,3500r/min离心(普通离心机)4分钟,吸弃上清液,加50μl TE水溶解沉淀。5.另取一灭菌EP管加入150μl白细胞裂解液,加入50μl上述溶解的单个核细胞,反复吹打。然后加入-20℃预冷的氯仿50μl,颠倒混匀。6.14000r/min离心(高速冷冻离心机)15分钟,小心吸取上清加入盛有100μl预致冷异丙醇的EP管中,颠倒混匀。7.14000r/min离心(高速冷冻离心机)15分钟,弃上清(注意标记离心方向),吸水纸上吸干,加300μl预致冷的75%乙醇,轻轻混匀。8.14000r/min离心(高速冷冻离心机)15分钟,弃上清(注意标记离心方向),吸水纸上吸干,4000r/min离心(高速冷冻离心机)10秒钟,以无菌吸头吸干残液。9.加入适量的DEPC水溶解RNA,2000r/min离心(台式高速离心机)5秒钟,将管壁残余液体甩至底部。二、外周血淋巴细胞总RNA的鉴定提取的外周血淋巴细胞总RNA,在紫外分光光度计上测定RNA的吸光度,将提取的RNA在1.5%低熔点琼脂糖凝胶变性电泳,可见5s,18s,28s三条清晰条带,表明所提RNA浓度较纯,且RNA完整无裂解,可用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。三、优化后的聚合酶链反应(PCR)扩增体系逆转录反应体系25μl,其中逆转录酶1μl,随机引物1μl,Taq酶0.2μl,上、下游引物各是0.4μl,以脱氧核苷酸为原料,在DNA合成仪上合成引物序。本专利技术所述的引物,HLA-B最佳引物是上游引物5′-CAC ACT GAC CTG GCA GCG GGAT-3′;下游引物5′-AGA GCCCTG GGC ACT GTC GCT-3′。等同效果的引物是上游引物15′-GGG CAG CTG TGGTGC CT-3′;25′-CTG CCG AAG CCC CTC ACC CTCT-3′;35′-GCC GTC TTC CCA GTCCAC CGT-3′。下游引物1′5′-CAC TGT CGC TGC ACG CAG CCT-3′;2′5’-AGGACCAGACCCAGGACA-3’;3′5′-ATG CCC ACG ATG GGG ACG GT-3′。HLA-A最佳引物是上游引物5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′;下游引物5′-AGAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法,首先抽取外周血,提取淋巴细胞(PBL),然后对淋巴细胞总RNA进行鉴定,当可见5s,18s,28s,三条清晰条带时,可用于逆转录聚合酶链反应,其特征在于:使逆转录聚合酶链反应体系为25ul,其中逆转录酶1ul,随机引物1ul,Taq酶0.2ul,上下游引物各是0.4ul,其中HLA-B和HLA-A引物均是4对,使用其中任何一对均可,其中RNA是10ul,得出多聚酶链反应参数是42℃30min,95℃3min,94℃1min,55℃1min,72℃1min,5个循环,94℃10sec,60℃40sec,40个循环,72℃5min,对扩增产物电泳扫描及序列分析,最后进行荧光定量检测,即:以引物为基础合成荧光探针,建立荧光定量逆转录聚合酶链反应,获得检测结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:邹雄张义杨晓静
申请(专利权)人:山东大学齐鲁医院
类型:发明
国别省市:88[中国|济南]

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