单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法技术

本发明专利技术是单个核细胞白细胞相容性抗原Ａ和Ｂ特异核糖核酸检测方法，一、外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）的提取，二、外周血淋巴细胞总ＲＮＡ的鉴定，三、优化后的聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增体系，四、扩增产物的电泳扫描及序列分析，五、荧光定量检测。采用本发明专利技术检测方法，检测结果是用１－２％琼脂糖凝胶电泳，正常人在２８７ｂｐ处可见明显亮带，免疫力低的人群则明显减弱或缺失，以此结果，可以判断是否是肿瘤患者，若是肿瘤患者筛选生物治疗的药物或治疗方法，可以提高肿瘤患者针对性的治疗效果，对尚未有临床症状的人群，提供应当增强免疫力的警示，对研究人员可以提供寻求提高细胞免疫力的中草药等。本发明专利技术可以普遍应用于健康查体。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学、免疫学检测领域，具体说是一种单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法。
技术介绍
通过检测人外周血单个核细胞，所含HLA-I特异核糖核酸的含量，用以评估人体的免疫力高低的方法，在临床常用的CD4+/CD8+比值，它的敏感性和特异性均不能满足临床需求，近几年发展的流式细胞术，测定HLA-I蛋白，影响因素较多，其评估值较难真实反映其客观性。其它LDH释放试验、MTT试验也不适合于临床上的监测。为此，国际上曾开展过有关细胞免疫标志性指标的讨论，至今仍无法定论。
技术实现思路
本专利技术目的是，提供一种单个核细胞白细胞相容性抗原A和B特异核糖核酸检测方法，通过其检测结果评估人体的免疫力，提高肿瘤的诊治水平，依此筛选对肿瘤患者生物治疗的药物或方法等，对尚未有临床症状的人群，寻求提高细胞免疫力的中草药等。本专利技术为了完成专利技术目的，提供以下技术方案首先抽取外周血，提取淋巴细胞(PBL)，然后对淋巴细胞总RNA进行鉴定，当可见5s，18s，28s，三条清晰条带时，可用于逆转录聚合酶链反应，使逆转录聚合酶链反应体系为25ul，其中逆转录酶1ul，随机引物1ul，Taq酶0.2ul，上下游引物各是0.4ul，其中HLA-B和HLA-A引物均是4对，使用其中任何一对均可，其中RNA是10ul，得出多聚酶链反应参数是42℃30min，95℃3min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，5个循环，94℃10sec，60℃40sec，40个循环，72℃5min，对扩增产物电泳扫描及序列分析，最后进行荧光定量检测，即以引物为基础合成荧光探针，建立荧光定量逆转录聚合酶链反应，获得检测结果。HLA-B引物是上游引物5′-CAC ACT GAC CTG GCA GCG GGAT-3′，下游引物5′-AGA GCC CTG GGCACT GTC GCT-3′。上游引物5′-GGG CAG CTG TGG TGC CT-3′，下游引物是5′-CACTGT CGC TGC ACG CAG CCT-3′。HLA-B引物是上游引物5′-CTG CCG AAG CCCCTC ACC CTCT-3′，下游引物是5′-AGG ACC AGA CCC AGG ACA-3′。HLA-B引物是上游引物5′-GCC GTC TTC CCA GTC CAC CGT-3′，下游引物是5′-ATG CCCACG ATG GGG ACG GT-3′。HLA-A引物是上游引物5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′，下游引物5′-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3′。HLA-A引物是上游引物5′-ATGAGGCGGAGCAGTTGA-3′，下游引物5′-ATGGTGGGCTGGGAAGAC-3′。HLA-A引物是上游引物5′-GAGGCGGAGCAGTTGAGA-3′，下游引物5′-GGAAGGGCAGGAACAACTC-3′。HLA-A引物是上游引物5′-GGAGGACCAGACCCAGGACA-3′，下游引物5’-ATGGTGGGCTGGGAAGAC-3’。本专利技术所述的引物，其中HLA-B有一对最佳引物，即上游引物5′-CAC ACT GAC CTG GCA GCG GGAT-3′，下游引物5′-AGA GCCCTG GGC ACT GTC GCT-3′。HLA-A有一对最佳引物，即HLA-A引物是上游引物5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′，下游引物5′-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3′。其它各对引物均可达到本专利技术所述的检测结果。本专利技术通过研究、临床及试验得出单个核细胞的HLA-A和HLA-B是个很好的评估细胞免疫力的指标，肿瘤病人敏感性和特异性均为80％以上，远高于其他指标。采用本专利技术检测方法，检测结果是用1-2％琼脂糖凝胶电泳，正常人在287bp处可见明显亮带，免疫力低的人群则明显减弱或缺失，以此结果，可以判断是否是肿瘤患者，若是肿瘤患者筛选生物治疗的药物或治疗方法，可以提高肿瘤患者针对性的治疗效果，对尚未有临床症状的人群，提供应当增强免疫力的警示，对研究人员可以提供寻求提高细胞免疫力的中草药等。本专利技术可以普遍应用于健康查体。具体实施例方式一、外周血淋巴细胞(PBL)的提取1.一次性注射器无菌抽取2ml外周血于含有EDTA-K2抗凝剂的无菌试管中。2.4小时内分离血浆，3000r/min离心5分钟(普通离心机)，以无菌吸管吸取白细胞层，加入盛有2ml生理盐水的无菌管中稀释，沿管壁缓慢加入盛有2ml淋巴细胞分离液的无菌管中(所有器材预先均用DEPC水处理)。3.3000r/min离心(普通离心机)25分钟，以无菌吸管小心吸取单个核细胞层至一灭菌EP管中，3500r/min离心(普通离心机)4分钟，吸弃上清液。4.加入0.5ml红细胞裂解液溶解其中少量残余红细胞，3500r/min离心(普通离心机)4分钟，吸弃上清液，加50μl TE水溶解沉淀。5.另取一灭菌EP管加入150μl白细胞裂解液，加入50μl上述溶解的单个核细胞，反复吹打。然后加入-20℃预冷的氯仿50μl，颠倒混匀。6.14000r/min离心(高速冷冻离心机)15分钟，小心吸取上清加入盛有100μl预致冷异丙醇的EP管中，颠倒混匀。7.14000r/min离心(高速冷冻离心机)15分钟，弃上清(注意标记离心方向)，吸水纸上吸干，加300μl预致冷的75％乙醇，轻轻混匀。8.14000r/min离心(高速冷冻离心机)15分钟，弃上清(注意标记离心方向)，吸水纸上吸干，4000r/min离心(高速冷冻离心机)10秒钟，以无菌吸头吸干残液。9.加入适量的DEPC水溶解RNA，2000r/min离心(台式高速离心机)5秒钟，将管壁残余液体甩至底部。二、外周血淋巴细胞总RNA的鉴定提取的外周血淋巴细胞总RNA，在紫外分光光度计上测定RNA的吸光度，将提取的RNA在1.5％低熔点琼脂糖凝胶变性电泳，可见5s，18s，28s三条清晰条带，表明所提RNA浓度较纯，且RNA完整无裂解，可用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。三、优化后的聚合酶链反应(PCR)扩增体系逆转录反应体系25μl，其中逆转录酶1μl，随机引物1μl，Taq酶0.2μl，上、下游引物各是0.4μl，以脱氧核苷酸为原料，在DNA合成仪上合成引物序。本专利技术所述的引物，HLA-B最佳引物是上游引物5′-CAC ACT GAC CTG GCA GCG GGAT-3′；下游引物5′-AGA GCCCTG GGC ACT GTC GCT-3′。等同效果的引物是上游引物15′-GGG CAG CTG TGGTGC CT-3′；25′-CTG CCG AAG CCC CTC ACC CTCT-3′；35′-GCC GTC TTC CCA GTCCAC CGT-3′。下游引物1′5′-CAC TGT CGC TGC ACG CAG CCT-3′；2′5’-AGGACCAGACCCAGGACA-3’；3′5′-ATG CCC ACG ATG GGG ACG GT-3′。HLA-A最佳引物是上游引物5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′；下游引物5′-AGAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
单个核细胞白细胞相容性抗原Ａ和Ｂ特异核糖核酸检测方法，首先抽取外周血，提取淋巴细胞（ＰＢＬ），然后对淋巴细胞总ＲＮＡ进行鉴定，当可见５ｓ，１８ｓ，２８ｓ，三条清晰条带时，可用于逆转录聚合酶链反应，其特征在于：使逆转录聚合酶链反应体系为２５ｕｌ，其中逆转录酶１ｕｌ，随机引物１ｕｌ，Ｔａｑ酶０．２ｕｌ，上下游引物各是０．４ｕｌ，其中ＨＬＡ－Ｂ和ＨＬＡ－Ａ引物均是４对，使用其中任何一对均可，其中ＲＮＡ是１０ｕｌ，得出多聚酶链反应参数是４２℃３０ｍｉｎ，９５℃３ｍｉｎ，９４℃１ｍｉｎ，５５℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，５个循环，９４℃１０ｓｅｃ，６０℃４０ｓｅｃ，４０个循环，７２℃５ｍｉｎ，对扩增产物电泳扫描及序列分析，最后进行荧光定量检测，即：以引物为基础合成荧光探针，建立荧光定量逆转录聚合酶链反应，获得检测结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邹雄，张义，杨晓静，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]