一种单分子dsDNA微阵列芯片制备方法技术

一种制备单分子双链脱氧核糖核酸（ｄｓＤＮＡ）微阵列芯片的新方法，包括步骤：　　　　（１）、固相化学合成两种单链寡核苷酸片段，一种为靶寡核苷酸，其５′端为两段反向碱基互补序列，３′端为通用寡核苷酸互补序列；另一种为通用寡核苷酸，其３′端为羟基，５′端为化学修饰基团；　　　　（２）、在液相反应体系中将该通用寡核苷酸与靶寡核苷酸复性；　　　　（３）、两寡核苷酸复性产物点样固定到固相支持物表面，形成寡核苷酸微阵列；　　　　（４）、寡核苷酸微阵列在片核酸聚合酶延伸，形成双分子ｄｓＤＮＡ微阵列；　　　　（５）、双分子ｄｓＤＮＡ微阵列变性，形成单链脱氧核糖核酸（ｓｓＤＮＡ）微阵列；　　　　（６）、ｓｓＤＮＡ微阵列复性，单链３′端形成发卡结构；　　　　（７）、复性后ｓｓＤＮＡ微阵列在片核酸聚合酶延伸，形成单分子ｄｓＤＮＡ微阵列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提出一种新的在固相支持物(solid sustracts)上制备单分子双链脱氧核糖核酸微阵列(unimolecular dsDNA microarray)的技术方法，所制备的单分子dsDNA微阵列芯片，在基础分子生物学及生物医学领域中具有重要的应用价值。在基础分子生物学研究中，本专利技术制备的单分子dsDNA微阵列芯片可以作为高通量(high throughput)鉴定DNA结合蛋白(DNA-binding proteins)的DNA结合靶点、筛选及检测DNA结合蛋白、分析DNA结合蛋白与其DNA结合靶点相互作用等的技术平台；在生物医学研究中，本专利技术制备的单分子dsDNA微阵列芯片可以作为DNA结合蛋白相关疾病辅助诊断、药物作用机理研究、药物有效成分筛选等的技术平台。
技术介绍
DNA/蛋白质的相互作用在基因组染色体结构维护等细胞结构和功能活动中担负重要作用，特别是序列特异性DNA/蛋白质相互作用(Sequence-specific DNA/protein interaction)在基因表达调控(gene expression regulation)和DNA重组(recombination)、限制(restriction)及复制(replication)等细胞功能中发挥极其重要的作用，因此DNA/蛋白质的相互作用是生物化学、分子生物学和生物物理学研究的重要内容，序列特异性DNA结合蛋白也是目前功能基因组(functional genome)和蛋白质组(proteome)研究的重要内容。因此，研究DNA/蛋白质相互作用的方法一直受到重视，并逐渐发展了多种研究技术，包括硝酸纤维素结合分析(Nitrocellulose-binding Assays)、凝胶迁移实验(Gel Mobility-shift Analysis)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、Southwestern印记(Southwestern blotting)、报告构体(Reporter Construct)，染色体免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)，噬菌体展示(Phage Display)，结合位点签名(Binding-site Signatures)，体外选择(in-vitro selection)，紫外交联(UVCrosslinking)，甲基化干扰分析(Methylization Interfering Assay)，X-射线晶体衍射(X-rayCrystallography)，原子力显微镜(Atomic Force microscopy，AFM)，表面激元共振(SurfacePlasmon Resonance，SPR)，毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)，扫描力显微镜(ScanningForce Microscopy，SFM)，脱氧核糖核酸酶足迹法(DNasel footprinting)，荧光足迹法(Fluorescence Footprinting)，荧光各向异性(Fluorescence Anisotropy)，荧光共振能量传递(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)等，这些技术方法能够非常有效地反应DNA/蛋白质相互作用的某一方面的特征，至今在实验研究中发挥重要作用；但这些方法都存在对实验样品消耗多、实验耗时长、分析效率低或存在放射性标记对实验人员及环境的危害等缺点，而且难以高通量获取DNA/蛋白质相互作用的生物信息。因此建立一种高通量的DNA/蛋白质相互作用的研究方法非常必要。生物芯片技术是近几年迅速崛起的一项极其重要的生物技术，它以微型化、平行化及自动化等技术特点，成为目前最有效地高通量获取生物信息的前沿技术。特别是生物分子、细胞或组织构成的微阵列芯片，在检测生物信号领域得到迅速地应用，尤其以基因芯片应用最数深入广泛。微阵列芯片高通量获取生物信息的特点为建立高通量DNA/蛋白质相互作用研究的新方法提供了新的技术思路。但由于分子生物学中发挥许多重要生物学作用的序列特异性DNA蛋白质相互作用都发生在基因组双链DNA与蛋白质分子之间，因此用于DNA多态性、DNA测序和基因表达研究的常规单链DNA微阵列芯片，都不能直接用于序列特异性DNA/蛋白质相互作用的研究。于是如何在固相载体表面制备双链DNA微阵列就成为科学家关注的焦点。在这一背景下，双链DNA(dsDNA)微阵列芯片应运而生，由于dsDNA微阵列芯片表面的分子探针为双链DNA，在分子结构上满足了细胞自然状况下DNA/蛋白质相互作用分子结构特征，因此dsDNA微阵列芯片成为目前高通量获取DNA/蛋白质相互作用生物信息的重要技术平台。Lockhart最早(1996)提出在固相基质表面制备由大量不同的单分子(unimolecular)dsDNA构成的核酸阵列(“library comprising a plurality of different members of unimolecular，double-stranded oligonucleotides on a solid support”)，使之用于筛选生物样品中肽、蛋白质等分子与阵列上的dsDNA相互作用的新思想和新方法(US.Pat.5556752)。该方法在固相基质表面原位合成或点样制备较长的单链寡核苷酸(ssDNAs)，这些单链寡核苷酸包含两段反向互补序列，通过链内退火形成“茎—环”(Stem-loop)结构，其中“茎”部dsDNA可用于检测DNA结合蛋白。Lockhart技术的重要贡献是最早将DNA微阵列技术引入到高通量检测DNA/蛋白质相互作用的研究领域，但他提出的dsDNA阵列制备方法在应用中却存在严重的技术和经济问题，其dsDNA阵列制备技术若借助光导向原位DNA微阵列合成技术，则不仅合成的全长dsDNA数量极少，使大部分合成寡核苷酸为残缺(truncated molecules)分子，严重干扰检测反应，而且生产成本非常高昂；若借助基因芯片点样法完成，则生产成本更加高昂。Mirzabekov等(1999，2001)提出运用杂交复性的方法制备dsDNA微阵列，他们首先制备ssDNA微阵列，再用互补单链寡核苷酸DNA与芯片杂交复性，使ssDNA微阵列芯片成为dsDNA微阵列芯片；这一方法最根本的缺点是不能用来制备碱基序列非常相似的dsDNA微阵列芯片，如单碱基多态性的dsDNA微阵列芯片，而且这一方法的实际生产成本也是难以接受的。Bulyk等在1999年提出了用核酸聚合酶引物延伸的办法将ssDNA微阵列转变为dsDNA微阵列方法，并申报了美国专利(US.Pat.6326489)。这一方法首先在玻片上通过Affymetrix光导向原位合成专利技术制备ssDNA微阵列，使ssDNA微阵列的每条寡核苷酸靠近玻片的3′端含有长16个碱基的通用(constant)引物退火序列，ssDNA微阵列与通用引物退火后，进行聚合酶引物延伸反应，合成第二链核酸，从而形成dsDNA微阵列。这一方法的优点是能利用DNA微阵列原位合成技术制备高密度dsDNA微阵列；但这一方法同样存本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，李同祥，陆祖宏，
申请(专利权)人：王进科，李同祥，陆祖宏，
类型：发明
国别省市：