中药材gDNA种质特异性微阵列芯片制备方法技术

中药材ｇＤＮＡ种质特异性微阵列芯片制备方法是以名贵中药材（石斛）为材料，提取其不同品种ｇＤＮＡ，用识别４个碱基的（如ＲｓａＩ酶）酶切，酶切产物为平头末端，通过抑制性差减杂交（ＳＳＨ），获取不同种间差异克隆片段并点样于玻片，采用ｄＣＴＰ－Ｃｙ３和ｄＣＴＰ－Ｃｙ５标记的ｇＤＮＡ扩增子与其杂交筛选到种质特异性探针，以这些大量的探针制备成可用于平行检别多个品种及真、伪的中药种质鉴定芯片。本发明专利技术以ｇＤＮＡ为鉴别的信息载体，在基因组（ｇＤＮＡ）水平上寻找获得种质特异性探针制备低成本、高通量、平行鉴别多种及真伪的中药种质鉴定芯片。获得的大量种质特异性探针，对中药的基因组特征研究及探索中药的遗传进化和生物学分类提供大量的信息，对于建立中药材种间、真伪鉴别系统基因库标准基因图谱具有非常重要的价值，同时，为道地药材和非道地药材质量差异的研究，以及优质中药材种质的筛选和育种栽培研究提供技术支撑，对中药的高通量鉴定，实现中药质量控制，促进中药现代化有广泛的应用价值。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是生物医学领域中制备中药鉴定微阵列芯片的方法。
技术介绍
中药鉴定作为中药质量标准的主要内容，不仅是在国内市场，更重要的是进入国际市场、实现中药现代化迫切需要解决的关键问题之一。我国药材资源丰富，动、植物中药约1万余种，但目前使用的商品药材来源、种类复杂，加之各地药材种使用习惯不尽相同，同名异药、同药异名，互混、互代以假充真混乱现象严重，药材伪、混品种充斥市场，且数量有增无减，长期困扰中药材市场，严重影响我国中药材的进出口和制药企业的中药产品质量，阻碍着中药的发展。为确保中药使用安全有效，控制中药质量，对各种中药材进行准确鉴定成为当务之急，同时准确鉴定中药品种是保证中医临床用药安全有效的前提。中药传统上是用经典的形态分类学和解剖学特征，从基原、性状、显微、理化及DNA分子遗传标记技术进行药材品种及真伪的鉴别。性状鉴别是利用感官对完整药材进行鉴别；显微鉴别是利用显微镜来观察药材的组织构造、细胞性状以及内含物的特性。理化鉴别是利用物理或化学的方法，对药材及其制剂所含的主要化学成分进鉴定，目前有薄层层析法、荧光法、紫外、红外光谱法等。这些方法对于动、植物药材以整体入药而保持其分类学性状特征的药材的鉴定确实是行之有效的。但是，这些方法要真正应用于中药材的鉴别还存在一些问题，一是因中药材的性状、组织结构、化学成分除了受中药材本身的遗传物质控制外，还受生长环境、气候、纬度等因素的影响而不同；二是因许多动、植物药材亲缘关系较近，外形与伪品类似或经过多道工序加工后已难辨别其原貌(如石斛加工成枫斗后)，导致上述鉴别方法结果的不稳定，不能满足中药鉴别的需要。DNA分子遗传标记技术是根据不同生物个体遗传物质DNA的差异来鉴别生物物种的方法。DNA作为遗传信息的直接载体，不受生长环境生理状态等因素的影响，因此，DNA分子遗传标记技术鉴别药材的方法虽然比上述方法都具有较高的准确性和可靠性，但都存在一定的局限性，很难推广应用，已报道的方法可归纳为三类(1)AP-PCR标记鉴别该方法在扩增反应时要求的复性温度低(通常为36℃)，特异性不高，结果容易受到多种因素的影响，在不同的实验室之间难以重复，即使在同一实验室内，每次检测样品时，都必须用已知的正品药材作为对照，同时进行DNA提取、RAPD扩增和电泳检测，比较正品药材与待检样品扩增产物电泳图谱的异同才能进行鉴定，检验成本高，因此很难推广。(2)RFLD标记鉴别该方法要求DNA无显著的降解，只适于新鲜动、植物材料的研究，它对于模板的纯度和完整性要求高，操作较烦琐，所需DNA模板的量大。中药材大多为干品，在加工、炮制、贮藏的过程中DNA的降解使得中药材RFLP结果非常不稳定，其PCR产物的片段长度有限，一般在1.5kb以下，能够找到的合适的限制性酶切位点数有限，重复性较差，目前推广应用仍有难度。(3)DNA测序法它利用某段已知的相对保守的基因片段进行PCR扩增，再进行序列测定加以鉴别。这种方法虽然准确性高，但所含信息量较少，测序成本高，目前一个约400bp的DNA片段费用为100元/反应，这尚不包括DNA提取和PCR扩增的费用，而且实验操作复杂，DNA易污染，出现鉴定错误，对大量样品的鉴别很不现实。由于上述各种用于中药鉴定技术存在的种种缺陷与不足，迄今尚未成为任何一种中药材鉴定的常规检测手段，而生物芯片技术为中药的鉴定展现了良好的发展前景。生物芯片是指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸及其他生物组分的准确、快捷、大信息量的检测。包括基因芯片、蛋白(多肽)芯片、多糖芯片和神经元芯片、细胞芯片、组织原位芯片等种类。其中，基因芯片是最重要的一种生物芯片，也是目前研究最多的一种生物芯片。基因芯片技术是基于碱基互补原理，在固体表面按一定的阵列集成大量的基因探针，通过与待测基因进行杂交反应，进而对大量基因进行平行瞬时分析检测的技术。目前生物芯片的研究和开发种类逐渐趋于多样化，其应用生物芯片可实现对待检样品中目标核酸分子、蛋白质分子、细胞、微小组织等物质的有无及多少进行准确、快速、大信息量检测，具有微型化、高通量和自动化的检测特征。生物芯片在生物检测、医学检测及疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的应用价值意义，因此受到广泛关注和投资，使其已经成为一个全球性的新型产业，即生物芯片产业。本专利技术创立的独特的中药材gDNA序列特异性微阵列芯片制备方法获取的种质特异性探针能有效地固定在固相支持物如玻片上建立一种低成本、准确性高、重现性好、高通量的中药材种质鉴定DNA芯片技术平台。
技术实现思路
(1)专利技术目的本专利技术目的是提供一种便于在普通设备条件下制备中药鉴定微阵列芯片的方法。以中药材gDNA为信息载体，通过限制性内切酶酶切、差减杂交、荧光PCR标记、种质特异性探针芯片筛选等实验，制备一种低成本、准确性高、重现性好、高通量的中药材种质鉴定芯片。(2)技术方案本专利技术是，其特征在于该制备方法包括如下步骤(1)差减克隆的制备提取各样本的gDNA，用识别4个碱基的(如RsaI酶)酶切，酶切产物为平头末端，理论上每44即256个碱基就有一个酶切位点，其酶切片段大小在150-500bp之间。设计合成一对用于套组PCR的接头adaptor1(图1(1))和adaptor2(图1(2))，以试验者样本作为Tester，以另一种样本作对照为Driver。Tester分两组分别连接不同的接头后，与过量的Driver进行两次液相杂交，在进行正向杂交的同时，也进行反向杂交试验，分别以设计引物primer1(图1(3))和一对套组PCR引物nested PCR primer1(图1(4))和nested PCR primer2(图1(5))进行两次PCR扩增，对在Tester中存在而在Driver中不存在的gDNA片段进行扩增富集。PCR产物用T-vecter克隆转化大肠杆菌，挑取白色重组子克隆，挑取的克隆转入96孔培养板培养。取0.5μl培养菌液，用5′端修饰有氨基的nestedPCR primer1(-NH2基用于在修饰过的玻片上的连接固定反应)和nested PCR primer2在96微孔板中扩增差异克隆。(2)gDNA扩增子的制备与标记gDNA酶切后，连接接头adaptor3(图1(6))，用引物primer3(图1(7))扩增时掺入dCTP-Cy3或dCTP-Cy5进行标记，其PCR产物直接用于杂交筛选。(3)种质特异性探针的芯片筛选将所有差异克隆用点样仪点样于硅烷化处理的玻片上，在一定条件下分别用荧光标记的不同样本扩增子杂交，用激光扫描仪进行扫描检测，筛选获取种质特异性探针。(4)种质特异性探针微阵列的制备将筛选到的所有样本种质特异性探针通过机器、手工或电泳等适当方式转移到固相支持物表面制备成微阵列。(3)技术效果本专利技术中药材gDNA序列特异性微阵列芯片制备方法在标准化、批量化生产及学术上有重要价值一是本专利技术以中药材的gDNA作为鉴别的信息载体，gDNA的信息量大，且不受外界因素和生物发育阶段及器官组织差异的影响，每一个体的任一体细胞均含相同的遗传信息，为在基因组水平上寻找获得种质特异性探针提供技术支持。二是本专利技术不同于以往传统的中药鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】
中药材ｇＤＮＡ种质特异性微阵列芯片制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：（ａ）提取各样本的ｇＤＮＡ，用识别４个碱基的平头末端酶酶切，酶切产物为平头末端，理论上每４↑［４］即２５６个碱基就有一个酶切位点，其酶切片段大小在１５０－ ５００ｂｐ之间。　（ｂ）通过抑制性差减杂交（ＳＳＨ）对在一个样本（设其为Ｔｅｓｔｅｒ即试验者）中存在而在另一样本（设其为Ｄｒｉｖｅｒ即躯赶者）中不存在的差异ｇＤＮＡ片段进行ＰＣＲ扩增富集。（ｃ）ＰＣＲ产物用Ｔ－ｖｅｃｔｅｒ克 隆转化大肠杆菌，挑取白色重组子克隆，挑取的克隆转入９６孔培养板培养。取０．５μｌ培养菌液，用５′端修饰有氨基的ｎｅｓｔｅｄＰＣＲｐｒｉｍｅｒ１（图１（４））和ｎｅｓｔｅｄＰＣＲｐｒｉｍｅｒ２（图１（５））在９６微孔板中扩增差 异克隆。（ｄ）ｇＤＮＡ用识别４个碱基的平头末端酶酶切后，连接接头ａｄａｐｔｏｒ３，用引物ｐｒｉｍｅｒ３扩增时掺入ｄＣＴＰ－Ｃｙ３或ｄＣＴＰ－Ｃｙ５进行标记的扩增子其ＰＣＲ产物直接用于杂交筛选。（ｅ）将所有差异克隆用点样仪点样 于硅烷化处理的玻片上，在一定条件下分别用荧光标记的不同样本扩增子（ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）杂交，用激光扫描仪进行扫描检测，筛选获取种质特异性探针。（ｆ）将获得的所有种质特异性探针制作成微阵列。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李同祥，王进科，陆祖宏，
申请(专利权)人：李同祥，王进科，陆祖宏，南京新益华集团有限公司，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]