标记过的核苷酸制造技术

披露了通过可裂解的接头基团与可检测的标记连接的核苷和核苷酸。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及标记过的核苷酸。具体地讲，本专利技术披露了具有可除去的标记的核苷酸，及其在多核苷酸测序方法中的用途。背景分子研究方面的进展部分是由于用于表征所述分子或它们的生物学反应的技术的改良。具体地讲，核酸DNA和RNA的研究，业已从用于序列分析的发展中的技术和杂交事件的研究中受益。业已改善了核酸研究的所述技术的一种例子，是固定化核酸的组装的阵列的发展。所述阵列通常包括固定在固体支持材料上的多核苷酸的高密度距阵。例如，参见Fodor等，Trends Biotech.1219-26，1994，该文献披露了组装核酸的方法，其中使用用掩膜保护的化学敏化的玻璃表面，不过，暴露了特定的部位，以便能够结合适当修饰过的核苷酸亚磷酰胺。组装的阵列还可以通过将已知的多核苷酸“点”在固体支持物的预定位置上而生产(例如Stimpson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926379-6383，1995)。阵列技术的另一种发展，是将所述多核苷酸连接在固体支持材料上，以便形成单分子阵列。这种类型的阵列披露于国际专利申请号WO00/06770中。所述阵列的优点是，可以在单分子水平上监测反应，并且可以从单个反应中采集到大量单分子的信息。为了使DNA阵列能够使用，必须确定所述分子的序列。美国专利号5,302,509披露了对固定在固体支持物上的多核苷酸进行测序的方法。所述方法取决于在存在DNA聚合酶的条件下，具有不同荧光标记的3′-封闭的碱基A，G，C和T向所述固定化多核苷酸中的掺入。所述聚合酶能够掺入与所述靶核苷酸互补的碱基，但是，能防止进一步添加3′-封闭基团。然后，可以确定所述掺入碱基的标记，并且通过化学裂解除去所述封闭基团，以便可以发生进一步的聚合。Welch等(Chem.Eur.J.5(3)951-960，1999)披露了用3′-O-封闭基团修饰的核苷三磷酸的合成，所述封闭基团是光不稳定性的，并且能发出荧光。打算将所述修饰过的核苷酸用于DNA测序实验。不过，证明了所述核苷酸难于掺入在现有的多核苷酸上，因为它不能结合到所述聚合酶的活性位点。Zhu等(Cytometry 28206-211，1997)还披露了通过所述碱基基团连接在所述核苷酸上的荧光标记的用途。希望将所述标记过的核苷酸，用于在原位杂交(FISH)实验中发出荧光，其中，需要一系列掺入的标记过的核苷酸，以便产生荧光“条形码”。专利技术概述在本专利技术中，通过与碱基连接的可裂解的接头基团，将核苷或核苷酸分子连接在可检测的标记上，使得所述分子可用于使用标记过的核苷或核苷酸的技术中，例如，测序反应，多核苷酸合成，核酸扩增，核酸杂交分析，单核苷酸多态性研究，以及其他使用诸如聚合酶，逆转录酶，末端转移酶，或其他DNA修饰酶的酶的其他技术。本专利技术特别适用于使用标记过的dNTPs的技术，如切口翻译，随机引物标记，末端标记(例如，使用末端脱氧核苷酸转移酶)，逆转录或核酸扩增。本专利技术的分子与现有技术不同，其中，所述标记连接在核糖或脱氧核糖上，或者，其中，所述标记是通过不可裂解的接头连接的。根据本专利技术的第一方面，核苷酸或核苷分子或它们的类似物具有通过可裂解的接头连接在可检测的标记上的碱基。本专利技术涉及具有通过可裂解的接头连接在可检测标记上的碱基的核苷酸或核苷分子。所述碱基可以是嘌呤或嘧啶。所述碱基可以是脱氮嘌呤。所述分子可以具有核糖或脱氧核糖糖部分。所述核糖或脱氧核糖可以包括通过2’或3’氧原子连接的保护基团。可以将所述保护基团除去，以便暴露出3’-OH基团。所述分子可以是脱氧核糖核苷三磷酸。所述可检测的标记可以是荧光团。所述接头可以是酸不稳定性接头，光不稳定性接头，或可以包括二硫键。本专利技术还涉及标记核酸分子的方法，其中，所述方法包括将核苷酸或核苷分子掺入到所述核酸分子上，其中，所述核苷酸或核苷分子具有通过可裂解的接头连接在可检测的标记上的碱基。所述掺入步骤可以通过末端转移酶，聚合酶或逆转录酶完成。所述碱基可以是嘌呤或嘧啶。所述碱基可以是脱氮嘌呤。所述核苷酸或核酸分子可以具有核糖或脱氧核糖糖部分。所述核糖或脱氧核糖可以包括通过2’或3’氧原子连接的保护基团。可以将所述保护基团除去，以便暴露出3’-OH基团。所述分子可以是脱氧核糖核苷三磷酸。所述可检测的标记可以是荧光团。所述接头可以是酸不稳定性接头，光不稳定性接头，或可以包括二硫键。所述可检测的标记和/或可裂解的接头可以具有足以阻止第二个核苷酸或核苷掺入到所述核酸分子上的大小。在另一方面，本专利技术涉及用于测定靶单链多核苷酸序列的方法，其中，所述方法包括监测互补性核苷酸的依次掺入，其中，每一个所述核苷酸具有通过可裂解的接头与可检测的标记连接的碱基。并且，其中，每一个掺入的核苷酸的身份是通过检测与所述碱基连接的标记确定的，并且，随后除去所述标记。本专利技术还涉及用于测定靶单链多核苷酸的序列的方法，其中，该方法包括(a)提供核苷酸，其中，所述核苷酸具有通过可裂解的接头与可检测的标记连接的碱基，并且，其中，所述与每一种类型的核苷酸连接的可检测的标记，在检测时可以与用于标记其他类型的核苷酸的可检测标记区分开来；(b)将核苷酸掺入到所述靶单链多核苷酸的互补体上；(c)检测(b)的核苷酸的标记，以便确定掺入的核苷酸的类型；(d)除去(b)的核苷酸的标记；和(e)任选重复步骤(b)-(d)一次或多次，以便测定靶单链多核苷酸的序列。在本文所披露的方法中，可以让每一个核苷酸依次与所述靶接触，在添加下一个核苷酸之前除去未掺入的核苷酸，其中，所述标记的检测和除去是在添加每一个核苷酸之后，或在添加所有四种核苷酸之后进行的。在所述方法中，可以让所有核苷酸同时与所述靶接触，即让包括所有不同核苷酸的组合物与所述靶接触，并且在检测之前除去未掺入的核苷酸，并且随后除去所述标记。所述方法可以包括第一个步骤和第二个步骤，其中，在第一个步骤中，让包括四种核苷酸中的两种的第一种组合物与所述靶接触，并且在检测之前除去未掺入的核苷酸，并且随后除去所述标记，并且，其中，在第二个步骤中，让包括第一种组合物中所不包括的两种核苷酸的第二种组合物与所述靶接触，并且在检测之前除去未掺入的核苷酸，并且随后除去所述标记，并且，其中，任选重复所述第一个步骤和第二个步骤一次或多次。本文所披露的方法还可以包括第一个步骤和第二个步骤，其中，在第一个步骤中，让包括四种核苷酸中的一种的组合物与所述靶接触，并且在检测之前除去未掺入的核苷酸，并且随后除去所述标记，并且，其中，在第二个步骤中，让包括第一种组合物中所不包括的三种核苷酸的第二种组合物与所述靶接触，并且在检测之前除去未掺入的核苷酸，并且随后除去所述标记，并且，其中，任选重复所述第一个步骤和第二个步骤一次或多次。本文所披露的方法还可以包括第一个步骤和第二个步骤，其中，在第一个步骤中，将包括四种核苷酸中的三种的组合物与所述靶接触，并且在检测之前除去未掺入的核苷酸，并且随后除去所述标记，并且，其中，在第二个步骤中，让包括第一种组合物中所不包括的核苷酸的组合物与所述靶接触，并且在检测之前除去未掺入的核苷酸，并且随后除去所述标记，并且，其中，任选重复所述第一个步骤和第二个步骤一次或多次。在另一方面，本专利技术涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括(a)各个核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核苷酸或核苷分子，具有通过可裂解的接头与可检测的标记连接的碱基。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：S巴拉苏布拉马尼安，C巴恩斯，刘小海，H斯维尔德罗，
申请(专利权)人：索雷克萨有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]