经过修饰的T细胞及其制备和使用方法技术
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经过修饰的T细胞及其制备和使用方法相关申请本申请要求2015年3月27日提交的美国临时申请号62/139,479的权益，所述美国临时申请的完整教义以引用的方式并入本文中。政府支持本专利技术在政府支持下以由美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授权的R01DK097768进行。美国政府享有本专利技术的权利。专利技术背景使用嵌合抗原受体(CAR)的T细胞疗法代表了癌症免疫疗法(例如，过继性免疫疗法)的重大突破并且作为尤其用于病毒和真菌感染的新治疗形式。数种障碍目前妨碍了CART疗法的安全翻译，如内源T细胞受体(TCR)的自身反应性风险、癌细胞或受感染细胞对T细胞的抑制和对自体T细胞移植物的依赖。专利技术概述需要经过修饰的T细胞和制备和使用所述T细胞的方法，所述T细胞克服了内源TCR的自身反应性、T细胞抑制，还使得能够将同种异体T细胞用于CART疗法。本专利技术针对解决这种需要并且具有其它所需特征的其它解决方法。本专利技术使用基因组编辑，如CRISPR和/或TALEN系统，来去除上述障碍。在CRISPR/Cas系统中，Cas蛋白可为例如Cas9或Cpf1。例如，为了克服自身反应性，本文中详述的工作设计并且测试了靶向TCRa和TCRb链的CRISPR/Cas指导RNA(gRNA)并且证明了JurkatT细胞中和原代人类T细胞中的高中靶活性和TCR表面表达的损失。归因于基因组编辑(例如，使用CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统)的多重能力，TCRa和/或TCRb也可与其它分子(例如，B2M、CTLA4、PD-1)组合被...
【技术保护点】
一种经过修饰的原代人类T细胞，其包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性；(c)(i)第三基因组修饰，其中染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，和/或(c)(ii)第四基因组修饰，其中染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性；和(d)第五基因组修饰，其中染色体15上的β2‑微球蛋白(B2M)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性；和各细胞任选地包含：(e)(i)至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.27 US 62/139,4791.一种经过修饰的原代人类T细胞，其包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性；(c)(i)第三基因组修饰，其中染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，和/或(c)(ii)第四基因组修饰，其中染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性；和(d)第五基因组修饰，其中染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHCI类分子表面表达和/或活性；和各细胞任选地包含：(e)(i)至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位；或编码所述至少一种嵌合抗原受体的外源核酸，和/或(e)(ii)至少一种外源蛋白，所述外源蛋白调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应；或编码所述蛋白的外源核酸。2.一种经过修饰的原代人类T细胞，其包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，所述第一连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的5’端上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏所述基因组DNA的第一连接延伸段的经过修饰的CTLA4基因，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，所述第二连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏所述基因组DNA的第二连接延伸段的经过修饰的PD1基因，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。3.一种经过修饰的原代人类T细胞，其包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性，其中所述基因组DNA的第一连接延伸段已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸和第一对具有选自由SEQIDNO:1-195和797-3637组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失；和/或(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性，其中所述基因组DNA的第二连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第二对具有选自由SEQIDNO:196-531和4047-8945组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失。4.如权利要求3所述的细胞，其中所述第一对核糖核酸包含SEQIDNO:128和SEQIDNO:72，并且其中所述第二对核糖核酸包含SEQIDNO:462和SEQIDNO:421。5.如权利要求2至4中任一项所述的细胞，其进一步包含：(c)(i)第三基因组修饰，其中染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，所述第三连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，和/或(c)(ii)第四基因组修饰，其中染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，所述第四连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。6.如权利要求5所述的细胞，其中所述基因组DNA的第三连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第三对具有选自由SEQIDNO:532-609和9102-9545组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失，和/或其中所述基因组DNA的第四连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第四对具有选自由SEQIDNO:610-765和9798-10532组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失。7.如权利要求6所述的细胞，其中所述第三对核糖核酸包含SEQIDNO:550和SEQIDNO:573，和/或其中所述第四对核糖核酸包含SEQIDNO:657和SEQIDNO:662。8.如权利要求2至7中任一项所述的细胞，其进一步包含：(d)第五基因组修饰，其中染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHCI类分子表面表达和/或活性。9.如权利要求8所述的细胞，其中所述基因组DNA的第五连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第五对具有选自包含SEQIDNO:766-780和10574-13257的组的序列的核糖核酸接触而缺失。10.如权利要求9所述的细胞，其中所述第五对核糖核酸包含SEQIDNO:773和SEQIDNO:778。11.如权利要求2至10中任一项所述的细胞，其进一步包含嵌合抗原受体或编码所述嵌合抗原受体的外源核酸。12.如权利要求11所述的细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。13.如权利要求2至12中任一项所述的细胞，其进一步包含至少一种外源蛋白，所述外源蛋白调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应；或编码所述蛋白的外源核酸。14.如权利要求1至13中任一项所述的细胞，其中所述T细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、组织浸润淋巴细胞和其组合组成的组。15.如权利要求1至14中任一项所述的细胞，其中所述细胞是获自患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。16.一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法，所述方法包括：(a)编辑原代人类T细胞中在染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；(b)编辑所述细胞中在染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性；(c)(i)编辑所述细胞中在染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，和/或(c)(ii)编辑所述细胞中在染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性；和(d)编辑所述细胞中在染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHCI类分子表面表达和/或活性；和任选地包括(e)(i)使所述细胞表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位，和/或(e)(ii)使所述细胞表达至少一种蛋白质，所述蛋白质调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应，其中(a)-(d)中的所述编辑包含使所述细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸，和在(a)中至少一个第一对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第一连接延伸段，在(b)中至少一个第二对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第二连接延伸段，在(c)(i)中至少一个第三对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第三连接延伸段，和/或在(c)(ii)中至少一个第四对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第四连接延伸段，和在(d)中至少一个第五对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第五连接延伸段。17.一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法，所述方法包括：(a)编辑原代人类T细胞中在染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，所述第一连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的5’端上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏所述基因组DNA的第一连接延伸段的经过修饰的CTLA4基因，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或(b)编辑原代人类T细胞中在染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，所述第二连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏所述基因组DNA的第二连接延伸段的经过修饰的PD1基因，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。18.一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法，所述方法包括：(a)使原代人类T细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸和第一对具有选自由SEQIDNO:1-195和797-3637组成的组的序列的核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，并且减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或(b)使原代人类T细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第二对具有选自由SEQIDNO:196-531和4047-8945组成的组的序列的核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，并且减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一对核糖核酸包含SEQIDNO:128和SEQIDNO:72，并且其中所述第二对核糖核酸包含SEQIDNO:462和SEQIDNO:421。20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其进一步包括：(c)(i)编辑所述细胞中在染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，所述第三连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，和/或(c)(ii)编辑所述细胞中在染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，所述第四连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。21.如权利要求20所述的方法，其中(c)(i)中的所述编辑包含使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第三对具有选自由SEQIDNO:532-609和9102-9750组成的组的序列的核糖核酸接触，和/或其中(c)(ii)中的所述编辑包含使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第四对具有选自由SEQIDNO:610-765和9798-10532组成的组的序列的核糖核酸接触。22.如权利要求21所述的方法，其中所述第三对核糖核酸包含SEQIDNO:550和SEQIDNO:573，和/或其中所述第四对核糖核酸包含SEQIDNO:657和SEQIDNO:662。23.如权利要求17至22中任一项所述的方法，其进一步包括：(d)编辑所述细胞中在染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHCI类分子表面表达和/或活性。24.如权利要求23所述的方法，其中(d)中的所述编辑包含使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第五对具有选自由SEQIDNO:766-780和10574-13257组成的组的序列的核糖核酸接触。25.如权利要求24所述的方法，其中所述第五对核糖核酸包含SEQIDNO:773和SEQIDNO:778。26.如权利要求17至25中任一项所述的方法，其进一步包括使所述细胞表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。27.如权利要求17至26中任一项所述的方法，其进一步包括使所述细胞表达至少一种蛋白质，当所述细胞接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质调节在所述相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应。28.如权利要求16至27中任一项所述的方法，其中所述T细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、组织浸润淋巴细胞和其组合组成的组。29.如权利要求16至28中任一项所述的方法，其中所述细胞是获自患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。30.一种组合物，其包含如权利要求1至15中任一项所述或根据如权利要求16至29中任一项所述的方法产生的细胞。31.一种治疗有需要的患者的方法，所述方法包括：(a)(i)将如权利要求1至15中任一项所述的经过修饰的T细胞施用于需要所述细胞的患者；(a)(ii)将根据如权利要求16至29中任一项所述的方法产生的经过修饰的T细胞施用于需要所述细胞的患者；或(a)(iii)将如权利要求30所述的组合物施用于需要所述细胞的患者。32.如权利要求31所述的方法，其中所述治疗包含过继性免疫疗法。33.如权利要求30或31所述的方法，其进一步包括在所述施用步骤之前使所述经过修饰的T细胞扩增。34.如权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述患者患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症。35.一种包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含：(a)编码Cas蛋白的核酸序列；(b)至少一种选自由以下组成的组的核糖核酸序列：(i)SEQIDNO:1-195和797-3637；(ii)SEQIDNO:196-531和4047-8945；(iii)SEQIDNO:532-609和9102-9750；(iv)SEQIDNO:610-765和9798-10532；(v)SEQIDNO:766-780和10574-13257；和(vi)(i)-(v)的组...
【专利技术属性】
技术研发人员：托斯滕·B·迈斯纳，卡本戈·Y·穆隆巴，莱奥纳尔多·M·R·费雷拉，沙达·A·考恩，
申请(专利权)人：哈佛学院校长同事会，
类型：发明
国别省市：美国,US
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