一种快速灵敏的定量分枝菌酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种在各种测试化合物存在的情况下在最大吸收范围介于４９０－５００ｎｍ时鉴定和定量分枝菌酸－品红染料复合体中分枝菌酸的快速、灵敏、简单和低成本的分光光度法。此法用于筛选用于抗微生物试剂和其诊断试剂盒的分枝菌酸生物合成抑制物，所述诊断试剂盒包括浓度范围介于０．１－１．０ｇｍ／１００ｍｌ的碱性品红染料、比例范围介于１∶４到２∶１（ｖ／ｖ）的苯酚和９５％的乙醇、比例范围介于１∶１４到１∶２５的苯酚和蒸馏水。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种在各种测试化合物存在的情况下在最大吸收范围介于490-500nm时鉴定和定量分枝菌酸-品红染料复合体中分枝菌酸的快速、灵敏、简单和低成本的分光光度法。此法用于筛选用于抗微生物试剂和其诊断试剂盒的分枝菌酸生物合成抑制物，所述诊断试剂盒包括浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、比例范围介于1∶4到2∶1(v/v)的苯酚和95％的乙醇、比例范围介于1∶14到1∶25的苯酚和蒸馏水。
技术介绍
由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)导致的结核是一公众健康难题，在最近二十年其重要性有所增加，部分是由于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和大量抗药菌株的出现所联合导致的病例数目的增加。其它通常难与结核杆菌区别的分枝杆菌也增加了。目前的检测方法是从临床分离的痰液、脑脊液、支气管洗涤液、角膜溃疡、骨髓以及抗酸细菌染色涂片检查呈阳性的临床标本中测定分枝菌酸的模式。标准的分枝菌酸提取方法被用来确保最大化的提取分枝菌酸衍生物，以增加方法的灵敏度。不同的层析柱被用来鉴定分枝菌酸的种类。对含有分枝菌酸的细菌的即时检测是通过抗酸细菌染色和显微镜检查进行的。普通染料不能渗透富含脂质的细胞壁。由碱性染料(品红)和苯酚(一种脂溶剂)组成的染料被用于此目的。苯酚部分溶解细胞壁，从而使品红透过细胞壁与分枝菌酸结合。品红一旦被结合甚至能抵抗暴露于酸性醇类的脱色，这是一个可以被用来表征未处理的临床标本、浓缩标本、和培养物中的分枝杆菌的特性。这一原则被广泛用于借助显微镜鉴定产生分枝菌酸的细菌。但是目前需要基于目视检测分枝菌酸的改进系统以从大量的植物化合物中筛选可能的抑制分枝菌酸生物合成的化合物。借助于分光光度计，检测和定量程序可以更加精确。抑制的量可以简单的通过在特定波长下的光密度测量来定量。这无需目前使用的用于检测的IR、NMR、GC光谱之类的复杂的高成本技术。不能被抗酸细菌染色再经显微镜检测定量的分枝菌酸的量可以通过系统的提取和染料结合再用分光光度分析来定量。由此设计了用于检测和定量分枝菌酸的简单、迅速、低成本的操作试剂盒，进而获得了鉴定分枝菌酸生物合成抑制物的高效率筛选方法。本领域具有提取、分离分枝菌酸和通过抗酸细菌染色检测产生分枝菌酸的细菌的方案。但是该系统总体而言是低效的，并需要用显微镜来检测产生分枝菌酸的细菌的存在。通过不同的层析和IR、NMR光谱法进行了相似的分枝菌酸的提取、分离和表征。我们在此强调将产生快速、低成本的筛选大量具有潜在的抑制分枝菌酸生物合成活力的植物提取物和化合物的系统。本专利技术的目的本专利技术的主要目的是发展快速、简单、灵敏、低成本的鉴定分枝菌酸的方法。本专利技术的另一主要目的是发展快速、简单、灵敏、低成本的定量分枝菌酸的方法。本专利技术进一步的目的是发展快速、简单、灵敏、低成本的鉴定和定量分枝菌酸的分光光度分析法。而本专利技术另一的目的是利用石炭酸-品红染料和分枝菌酸复合体来发展快速、简单、灵敏、低成本的鉴定和定量分枝菌酸的分光光度分析法。本专利技术还有一目的是发展筛选测试化合物对分枝菌酸的抑制特性的方法。本专利技术还有一目的是发展由分光光度技术检测分枝菌酸的试剂盒。专利技术概述本专利技术涉及一种在各种测试化合物存在的情况下在最大吸收范围介于490-500nm时鉴定和定量分枝菌酸-品红染料复合体中分枝菌酸的快速、灵敏、简单和低成本的分光光度分析法。此法用于筛选用于抗微生物试剂和诊断试剂盒的分枝菌酸生物合成抑制物，所述诊断试剂盒包括浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、比例范围介于1∶4到2∶1(v/v)的苯酚和95％的乙醇、比例范围介于1∶14到1∶25的苯酚和蒸馏水。专利技术详述因此，本专利技术涉及一种在各种测试化合物存在的情况下在最大吸收范围介于490-500nm时鉴定和定量分枝菌酸-品红染料复合体中分枝菌酸的快速、灵敏、简单和低成本的分光光度分析法。此法用于筛选用于抗微生物试剂和诊断试剂盒的分枝菌酸生物合成抑制物，所述诊断试剂盒包括浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、比例范围介于1∶4到2∶1(v/v)的苯酚和95％的乙醇、比例范围介于1∶14到1∶25的苯酚和蒸馏水。在本专利技术的一实施方案中，提供了在测试化合物或提取物存在和不存在的情况下，通过定量细菌产生的分枝菌酸来筛选用作抗微生物试剂的分枝菌酸生物合成抑制物的快速、简单、灵敏和低成本的方法。在本专利技术的另一实施方案中，在所述化合物或提取物存在和不存在的情况下对所述细菌进行持续40-60小时的单独培养。而在本专利技术的另一实施方案中，冻干沉淀的菌体。还在本专利技术的另一实施方案中，通过传统的方法提取分枝菌酸。还在本专利技术的另一实施方案中，将分枝菌酸溶解于己烷以获得分枝菌酸溶液。还在本专利技术的另一实施方案中，以1∶4到4∶1(v/v)的比例范围将所述溶液加入到石炭酸-品红染料中。还在本专利技术的另一实施方案中，强烈摇动步骤(e)的产物以获得上层粉红色的分枝菌酸-染料复合体。还在本专利技术的另一实施方案中，在波长介于490-500nm的范围内用分光光度计定量所述分枝菌酸。还在本专利技术的另一实施方案中，在化合物处理的细菌培养物中测定分枝菌酸生物合成的抑制程度。还在本专利技术的另一实施方案中，其中用分光光度法定量分枝菌酸水平的优选波长范围介于494-496纳米。还在本专利技术的另一实施方案中，其中石炭酸品红染料与所述提取物的优选比例为1∶1(v/v)。还在本专利技术的另一实施方案中，其中石炭酸品红由浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、苯酚、95％的乙醇和蒸馏水组成，其中苯酚和乙醇的比例范围介于1∶4到2∶1(v/v)，苯酚和蒸馏水的比例范围介于1∶25到1∶14(v/v)。还在本专利技术的另一实施方案中，其中所述具有抑制活性的测试化合物或提取物以最小抑制浓度(MIC)的1/25至1/2被加入。还在本专利技术的另一实施方案中，其中所述抗微生物试剂被发展来抵抗分枝杆菌、棒状杆菌、诺卡氏菌之类的微生物。还在本专利技术的另一实施方案中，其中所述方法被用于筛选选自合成、半合成、天然化合物和提取物的抑制物。还在本专利技术的另一实施方案中，其中颜色强度随着分枝菌酸浓度的增加而增加。还在本专利技术的另一实施方案中，其中所述方法适用于所有来源的分枝菌酸。在本专利技术进一步的实施方案中，提供了用于鉴定抗产生分枝菌酸的微生物的潜在抗微生物药物的试剂盒，所述试剂盒包含石炭酸品红、甲醇、甲苯、己烷、浓硫酸、菌体和测试化合物或提取物，所述成分的比例为甲醇∶甲苯介于1∶3到3∶1(v/v)的范围，甲醇∶己烷介于8∶1到2∶1(v/v)的范围，浓硫酸∶己烷介于1∶8到1∶2(v/v)的范围，石炭酸品红∶己烷提取物介于1∶4到4∶1(v/v)的范围，上述比例的甲醇、甲苯和浓硫酸被加入到冻干的菌体中，最终浓度都介于0.1-3.0gm/100ml。还在本专利技术的另一实施方案中，其中石炭酸品红由浓度范围介于0.1-1.0gm/100ml的碱性品红染料、苯酚、95％乙醇和蒸馏水组成，其中苯酚和乙醇的比例范围介于1∶4到2∶1(v/v)，苯酚和蒸馏水的比例范围介于1∶14到1∶25(v/v)。还在本专利技术的另一实施方案中，其中所述菌体选自分枝杆菌、棒状杆菌和诺卡氏菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
在测试化合物或提取物存在和不存在的情况下，通过定量细菌产生的分枝菌酸来筛选用作抗微生物试剂的分枝菌酸生物合成抑制物的快速、简单、灵敏和低成本的方法，所述方法包括：　　　　ａ．在所述化合物或提取物存在和不存在的情况下对所述细菌进行持续４０－６０小时的单独培养，　　　　ｂ．冻干菌体，　　　　ｃ．用传统方法提取分枝菌酸，　　　　ｄ．在己烷中溶解提取的分枝菌酸，以获得分枝菌酸溶液，　　　　ｅ．以１∶４到４∶１（ｖ／ｖ）的比例将所述溶液加入到石炭酸－品红染料中。　　　　ｆ．剧烈摇动步骤（ｅ）的产物以获得上层粉红色的分枝菌酸－染料复合体。　　　　ｇ．在波长介于４９０－５００ｎｍ的范围内用分光光度分析法定量所述分枝菌酸。　　　　ｈ．在所述化合物处理的细菌培养物中测定分枝菌酸生物合成的抑制程度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：SPS卡努加，S斯里瓦斯塔瓦，TRS库马尔，AK夏沙尼，MP达罗卡，S阿瓦斯蒂，
申请(专利权)人：科学与工业研究会，
类型：发明
国别省市：IN[印度]