一种中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定引物序列及其鉴定方法，鉴定引物序列为：引物１：５’－ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＴＣ－３’，引物２：５’－ＡＡＣ ＴＣＧ ＴＧＡ ＣＡＡ ＣＣＡ ＣＡＣ－３’。具体方法为：药材ＤＮＡ的提取：按常规方法进行，用无离子水将受试样品模板ＤＮＡ浓度调节至０．２～０．５ｎｇ／μｌ；鉴别性聚合酶链式反应：反应体系以５０μｌ为参考，引物用无离子水调至１０ｐｍｏｌ／μｌ；鉴定反应条件：在基因扩增仪上进行，９４℃预变性５分钟，然后进行４０次循环反应；反应产物的电泳检测：取出上述反应混和液６～８μｌ，与２μｌ加样缓冲液混合均匀，用２％琼脂糖凝胶，电压５ｖ／ｃｍ，电泳检测扩增结果；若阳性，则为正品；若为阴性，则不为正品。本发明专利技术能够对肉苁蓉药材能够准确鉴别其真伪，有益于控制药材质量，同样适用于海关检验等相关部门的使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是一种用于分子生物学方法检测中药材的
的鉴定引物序列及其鉴定方法，特别是一种。
技术介绍
中药肉苁蓉(Herba Cistanches)为列当科植物肉苁蓉(Cistanche deserticolaY.C.Ma)的干燥带鳞叶的肉质茎，是传统的补益中药。现代研究证明肉苁蓉具有调节神经内分泌系统、免疫调节、抗氧化、增强体力和抗疲劳、抗肝炎、抗肿瘤、通便作用以及镇静、抗衰老及促进创伤愈合等作用。肉苁蓉生于干旱沙漠，为根寄生植物，寄主为梭梭(Haloxylon ammodena Bunge)、白梭梭(H.persicum Bunge)、柽柳、盐爪爪、珍珠柴和白刺等。肉苁蓉属植物全世界约有20余种，主要分布于欧、亚洲温暖的干燥地区，我国分布有4种，即肉苁蓉、盐生肉苁蓉(C.salsa(C.A.Mey.)G.Beck)、管花肉苁蓉(C.tubulosa(Schrenk.)R.Wight)、沙苁蓉(C.sinensis G.Beck)，其中肉苁蓉为《中华人民共和国药典》规定的中药肉苁蓉的基源植物，因其药材粗壮、密被鳞片、质感柔润而备受欢迎。由于肉苁蓉生长繁殖的特殊性，加之疗效显著而被人为的滥挖以及大批砍伐其寄主梭梭，致使肉苁蓉野生资源急骤减少，因此同属其它植物也在各地区作肉苁蓉入药。市场上甚至有锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)混淆使用。鉴于肉苁蓉药材资源紧缺以及市场上伪品较多等问题，因此需要快速、准确鉴别药材真伪的方法。然而传统的形态及理化方法鉴定要求有一定的经验，对于破碎后的药材就更加难以准确鉴别。基于DNA序列的分子遗传标记技术则不存在这方面的问题，同时具有用量少、效率高、准确可靠的特点。对于肉苁蓉的开发与生产有着重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种。使其能够对肉苁蓉药材准确鉴别其真伪，有益于控制药材质量，同样适用于海关检验等相关部门的使用。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术肉苁蓉聚合酶链式反应的鉴定引物序列为引物15’-AGA GAG AGA GAG AGA GTC-3’，引物25’-AAC TCG TGA CAA CCA CAC-3’。本专利技术的中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定方法为1)药材DNA的提取按常规方法进行，用无离子水将受试样品模板DNA浓度调节至0.2～0.5ng/μl。2)鉴别性聚合酶链式反应反应体系以50μl为参考，引物用无离子水调至10pmol/μl，各试剂的用量分别为10×TaqDNA聚合酶缓冲液 5μlMgCl2(25mM) 3μldNTP(10mM) 1μl引物1 1.5～2.0μl引物2 1.5～2.0μl供试样品DNA模板40～60ngTaq DNA聚合酶 1.0～2.0单位无离子水 加到50μl混匀后，瞬时离心3)鉴定反应条件反应在基因扩增仪上进行，94℃预变性5分钟，然后按照下列参数进行40次循环反应变性94℃ 50秒复性50～55℃ 1分钟延伸72℃ 1分钟循环结束后在72℃保持8分钟，反应结束后在4℃保存。4)反应产物的电泳检测取出上述反应混和液6～8μl，与2μl加样缓冲液混合均匀，用2％琼脂糖凝胶，电压5v/cm，电泳检测扩增结果。所述的2％琼脂糖凝胶是指含0.5％溴化乙锭，即EB。5)若有阳性扩增，则供试样品为正品肉苁蓉；若为阴性，即无扩增条带，则供试样品不为肉苁蓉。本专利技术解决了中药材肉苁蓉真伪的鉴别问题，在对肉苁蓉的研究中设计了可以鉴别肉苁蓉的一对高效特异性引物。该引物在给定的反应条件下只特异性地鉴别肉苁蓉，对于其他种类的肉苁蓉药材或伪品均不能扩增出该基因片段。由于应用了聚合酶链式反应的方法，因此可以快速方便地检测样品的真伪，通常只需要极少量的样品，用此引物还可以制造用于肉苁蓉鉴别的试剂盒。本专利技术对于从事中药生产、销售的部门快速准确地鉴定肉苁蓉，控制药材质量是十分必要，对于各地药检部门打击假冒伪劣药材，净化药材市场将是十分有效的。肉苁蓉植物为濒危保护植物，其资源的保护尤为重要，本专利技术的方法同样适用于海关检验等相关部门的使用。附图说明图1是实施例的聚合酶链式反应结果示意图其中M为100bp分子量梯度，1为盐生肉苁蓉，2为沙苁蓉，3为肉苁蓉，4为管花肉苁蓉，5为空白对照。具体实施方法首先用植物DNA提取试剂盒(QIAGEN，Germany)从不同肉苁蓉植物中提取总DNA，用ISSR-PCR方法扩增并比较扩增产物，对不同种植物的特异性片段进行纯化、克隆，并测序，根据测序后DNA序列再设计引物并进行不同植物样品的PCR扩增，直至根据克隆、测序所获得的引物能够针对某种植物或药材只能扩增出单一条带。针对肉从药材以及伪、混品出现的情况，分别设计一对鉴别性PCR引物引物15’-AGA GAG AGA GAG AGA GTC-3’，引物25’-AAC TCG TGA CAA CCA CAC-3’。用全自动DNA合成仪按上述DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物的白色粉末结晶。以上均为本专利技术的基础工作，本专利技术的使用者只需按实施例实施即可药材DNA的提取按常规方法进行，用无离子水将受试样品模板DNA浓度调节至0.2～0.5ng/μl。鉴别性聚合酶链反应反应体系以50μl为参考，引物用无离子水调至10pmol/μl，各物品的用量分别为10×TaqDNA聚合酶缓冲液 5μlMgCl2(25mM) 3μldNTP(10mM) 1μl引物117μl引物216μl供试样品DNA 2.0～3.0μlTaq DNA聚合酶1.0单位无离子水 加到50μl混匀后，瞬时离心。聚合酶链反应条件反应在PCR仪上进行，94℃预变性5分钟，然后按照下列参数进行40次循环反应变性94℃ 50秒复性50～55℃ 1分钟延伸72℃ 1分钟循环结束后在72℃保持8分钟，反应结束后在4℃保存。反应产物的电泳检测取出上述反应混和液6～8μl，与2μl加样缓冲液混合均匀，用2％琼脂糖凝胶(含0.5％溴化乙锭，即EB)，电压5v/cm，电泳检测扩增结果，如图1所示。权利要求1.一种中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定引物序列，其特征在于，肉苁蓉聚合酶链式反应的鉴定引物序列为引物15’-AGA GAG AGA GAG AGA GTC-3’，引物25’-AAC TCG TGA CAA CCA CAC-3’。2.一种中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定方法，其特征是，具体方法为1)药材DNA的提取按常规方法进行，用无离子水将受试样品模板DNA浓度调节至0.2～0.5ng/μl；2)鉴别性聚合酶链式反应反应体系以50μl为参考，引物用无离子水调至10pmol/μl；3)鉴定反应条件反应在基因扩增仪上进行，94℃预变性5分钟，然后进行40次循环反应；4)反应产物的电泳检测取出上述反应混和液6～8μl，与2μl加样缓冲液混合均匀，用2％琼脂糖凝胶，电压5v/cm，电泳检测扩增结果；5)若有阳性扩增，则供试样品为正品肉苁蓉；若为阴性，即无扩增条带，则供试样品不为肉苁蓉。3.根据权利要求2所述的中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定方法，其特征是，所述的聚合酶链式反应各试剂的用量分别为10×TaqDNA聚合酶缓冲液5μl，MgCl2(25本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定引物序列，其特征在于，肉苁蓉聚合酶链式反应的鉴定引物序列为： 引物１：５’－ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＴＣ－３’， 引物２：５’－ＡＡＣ ＴＣＧ ＴＧＡ ＣＡＡ ＣＣＡ ＣＡＣ－３’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李晓波，屠鹏飞，金鑫，王敬，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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