THCA合成酶表达改变的大麻植物制造技术

本申请涉及新的遗传改造的植物和方法或材料，例如用于生产它们的多核苷酸、表达盒或载体。此外，本发明专利技术涉及改变植物中的大麻素含量和源自这种植物的医用组合物。在具体的实施方案中，本发明专利技术涉及四氢大麻酚酸(THCA)合成酶表达改变的大麻植物，和通过改变THCA合成酶表达来改变大麻中δ‑9‑四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)的量的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】THCA合成酶表达改变的大麻植物相关申请的交叉引用本申请要求于2015年5月28日提交的美国临时专利申请号62/167,462的权益，所述申请通过引用以其整体并入本文。序列表的并入计算机可读形式的序列表通过电子呈递与本申请一起提交。序列表通过引用以其整体并入，包含于2016年5月23日创建的文件名为“TWED002WO_ST25.txt”的文件中，所述文件的大小为112kb(在MSWindows操作系统中测量)。
本专利技术涉及遗传改造的大麻植物和大麻植物衍生产品以及用于制备其的表达盒、载体、组合物、和材料和方法。具体地，本专利技术涉及四氢大麻酚酸(THCA)合成酶表达改变的大麻植物，和通过改变THCA合成酶表达来改变大麻中δ-9-四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)的量的方法。
技术介绍
历史上，大麻(也称为大麻(marihuana)或大麻(marijuana))已用于医用目的。已经表明，大麻作为食欲刺激剂、止吐剂、镇痛剂在管理各种病症例如青光眼、帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化和慢性炎症中提供治疗益处。大麻含有许多化学上不同的成分，其中很多具有治疗性质。医用大麻中的主要治疗成分是δ-9-四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)。THC是大麻作用于精神的主要成分，且已经证明作为止吐剂、镇痛剂在青光眼的管理中提供治疗益处。相反，具有高比例THC的医用大麻品系可能造成焦虑感和/或方向障碍。CBD是大麻中非作用于精神的主要成分。CBD是5-羟色胺受体激动剂，且已经证明在神经病理性疼痛和神经炎症的治疗中具有治疗益处。高剂量CBD的副作用包括可变的嗜睡和镇静。大麻中特定组分的量可能影响治疗的功效和潜在的副作用。因此，具有改变的治疗组分谱的大麻植物可用于生产医用大麻和/或用于生产特定组分。专利技术简述描述了用于改变大麻植物中一种或多种大麻素含量的方法，该方法包括下调大麻植物中四氢大麻酚酸(THCA)合成酶的活性。在具体的实施方案中，方法包括在大麻植物中降低δ-9-四氢大麻酚(THC)含量，升高大麻二酚(CBD)含量，或降低THC且升高CBD含量，方法包括下调大麻植物中四氢大麻酚酸(THCA)合成酶的活性。在一些实施方案中，下调THCA合成酶的活性包括在植物中引入表达盒，所述表达盒包含有效抑制THCA合成酶表达的编码反义RNA或siRNA的选择DNA，所述选择DNA与异源启动子可操作连接。在具体的实施方案中，方法可以进一步包括选择相对于不包含表达盒的类似基因型的大麻植物具有降低水平的THCA合成酶mRNA的大麻植物，或选择相对于不包含表达盒的类似基因型的大麻植物具有降低的THC含量、升高的CBD含量或降低的THC含量和升高的CBD含量的大麻植物。在具体的实施方案中，引入表达盒包括遗传转化。在一些实施方案中，异源启动子可以选自叶特异性启动子、花特异性启动子、THCA合成酶启动子、CaMV35S启动子、FMV35S启动子和tCUP启动子。在某些方面，siRNA由以下多核苷酸序列编码：与选自SEQIDNO:61、63、64、69、71、72、68的序列和其补体具有至少85％序列一致性的多核苷酸序列；或包含选自SEQIDNO:61、63、64、69、71、72、68的序列和其补体的至少21个连续核苷酸的多核苷酸序列；或包含THCA合成酶的至少21个连续核苷酸的多核苷酸序列或其补体，THCA与选自SEQIDNO：1-47的序列具有至少85％序列一致性。在其他方面，反义RNA由以下多核苷酸序列编码：能够降低THCA合成酶表达的包含SEQIDNO：81或其片段的多核苷酸序列；或与SEQIDNO：81的至少200个连续核苷酸具有至少85％一致性的多核苷酸，其中选择DNA的转录抑制THCA合成酶的表达。在其他实施方案中，下调THCA合成酶的活性包括：向大麻植物或其细胞中引入(i)包含至少一个核定位信号的至少一种RNA导向的核酸内切酶，或编码包含至少一个核定位信号的至少一种RNA导向的核酸内切酶的核酸，(ii)至少一种向导RNA或编码至少一种向导RNA的DNA，和任选的(iii)至少一种供体多核苷酸，和培养大麻植物或其细胞从而每个向导RNA将RNA导向的核酸内切酶引导至染色体序列中的靶标位点，其中所述RNA导向的核酸内切酶将双链断裂引入靶标位点，且所述双链断裂通过DNA修复过程修复，从而改造染色体序列，其中所述靶标位点位于THCA合成酶基因中，且所述染色体改造阻断或干扰THCA合成酶基因的转录和/或翻译。在进一步的实施方案中，下调THCA合成酶的活性包括：在大麻植物或其细胞中鉴定DNA序列内的至少一个THCA合成酶基因座，鉴定所述至少一个THCA合成酶基因座内的至少一个定制核酸内切酶识别序列，向至少一种大麻植物或其细胞中引入至少第一定制核酸内切酶，其中所述大麻植物或其细胞包含在THCA合成酶基因座内或附近的定制核酸内切酶的识别序列，且所述定制核酸内切酶瞬时或稳定表达，分析大麻植物或其细胞中组成THCA合成酶基因座的DNA或THCA合成酶基因座侧翼的DNA中定制核酸内切酶介导的改造，和将大麻植物、其细胞或其后代细胞鉴定为包含THCA合成酶基因座的改造。在各种实施方案中，还包括由该方法产生的转基因大麻植物，和转基因植物的种子，其中所述种子包含表达盒。其他实施方案包含δ-9-四氢大麻酚(THC)含量降低、大麻二酚(CBD)含量升高，或THC降低且CBD含量升高的大麻植物，其包含降低的四氢大麻酚酸(THCA)合成酶表达。在某些方面，大麻植物包含编码有效抑制THCA合成酶表达的反义RNA或siRNA的选择DNA，所述选择DNA与异源启动子可操作连接，其中相对于不包含选择DNA的类似基因型的大麻植物，所述大麻植物包含降低的THC含量、升高的CBD含量，或降低的THC和升高的CBD含量。在具体的实施方案中，大麻植物衍生产品包含按重量计合并浓度为约18％至约60％的大麻二酚酸和大麻二酚，和/或按重量计合并浓度为约0％至约3％的δ-9-四氢大麻酚和四氢大麻酚酸。在各种实施方案中，大麻植物衍生产品包含大麻油、大麻酊、干大麻花、和/或干大麻叶，和/或也可调整用于吸入、口服、舌下服用或局部服用。在一个具体的实施方案中，包括用于生产医用大麻组合物的方法，所述方法包括获得大麻植物，在植物生长条件下种植大麻植物以从大麻植物生产植物组织，和从植物组织制备医用大麻组合物。还描述了包含与异源启动子可操作连接的选择DNA的重组表达盒，所述选择DNA编码有效抑制四氢大麻酚酸(THCA)合成酶基因的反义RNA、RNAi或siRNA。在具体的实施方案中，THCA合成酶基因包含与选自SEQIDNO：1-47的序列具有至少83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，异源启动子是叶特异性启动子或花特异性启动子；在植物中功能性的启动子；和/或选自CaMV35S启动子、FMV35S启动子和tCUP启动子的启动子。在各种实施方案中，选择DNA编码包含与THCA合成酶基因的至少21个连续核苷酸互补的序列的siRNA；编码能够降低THCA合成酶基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于改变大麻植物的一种或多种大麻素的含量的方法，所述方法包括下调所述大麻植物中四氢大麻酚酸(THCA)合成酶的活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.28 US 62/167,4621.一种用于改变大麻植物的一种或多种大麻素的含量的方法，所述方法包括下调所述大麻植物中四氢大麻酚酸(THCA)合成酶的活性。2.权利要求1所述的方法，其中改变大麻素的含量包括在所述大麻植物中降低δ-9-四氢大麻酚(THC)含量或升高大麻二酚(CBD)含量。3.权利要求1所述的方法，其中所述下调包括向所述植物引入有效抑制THCA合成酶表达的编码反义RNA或siRNA的选择DNA，所述选择DNA与异源启动子可操作连接。4.权利要求2所述的方法，进一步包括选择相对于不包含选择DNA的类似基因型的大麻植物，具有期望的降低的THC含量、升高的CBD含量或降低的THC含量和升高的CBD含量的大麻植物。5.权利要求3所述的方法，其中引入选择DNA包括遗传转化。6.权利要求3所述的方法，其中所述siRNA由以下编码：(a)与选自SEQIDNO:61、63、64、69、71、72、68的序列和其补体具有至少85％序列一致性的多核苷酸序列；(b)包含选自SEQIDNO:61、63、64、69、71、72、68的序列和其补体的至少21个连续核苷酸的多核苷酸序列；或(c)包含THCA合成酶的至少21个连续核苷酸的多核苷酸序列或其补体，所述THCA与选自SEQIDNO：1-47的序列具有至少85％序列一致性。7.权利要求3所述的方法，其中所述反义RNA由以下编码：(a)能够降低THCA合成酶表达的包含SEQIDNO：81的多核苷酸序列或其片段；或(b)与SEQIDNO：81的至少200个连续核苷酸具有至少85％一致性的多核苷酸序列，其中所述选择DNA的转录抑制THCA合成酶的表达。8.权利要求1所述的方法，其中下调THCA合成酶的活性包括：(a)向大麻植物或其细胞中引入(i)包含至少一个核定位信号的至少一种RNA导向的核酸内切酶，或编码包含至少一个核定位信号的至少一种RNA导向的核酸内切酶的核酸，(ii)至少一种向导RNA或编码至少一种向导RNA的DNA，和任选的(iii)至少一种供体多核苷酸，和(b)培养所述大麻植物或其细胞，从而每个向导RNA将RNA导向的核酸内切酶引导至染色体序列中的靶标位点，其中所述RNA导向的核酸内切酶将双链断裂引入.靶标位点，且所述双链断裂通过DNA修复过程修复，从而改造染色体序列，其中所述靶标位点位于THCA合成酶基因，且所述染色体改造阻断或干扰THCA合成酶基因的转录和/或翻译。9.权利要求8...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·A·博德克，T·希普利四世，D·约翰逊，
申请(专利权)人：推德有限公司，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA