核酸在制备评价患者的疾病状态的诊断试剂中的用途制造技术

本发明专利技术涉及用于评价疾病状态的存在于血浆和血清中的非颗粒相关和颗粒相关核酸。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于评价疾病状态的存在于血浆和血清中的非颗粒相关和颗粒相关核酸。
技术介绍
为了辅助对患者疾病的检测、预后判断、诊断、监测和治疗，目前世界上需要简便和准确地评价患者疾病状态的新方法。近来有发现表明，血浆或血清中的循环核酸与某些疾病状态有关(见Lo YMD等，N Eng J Med 1998；3391734-8；Lo YMD等，Lancet 1997；350485-7；Lo YMD等，Am J Hum Genet 1998；62768-75；Chen XQ等，NatMed 1996；21033-5；Nawroz H等，Nat Med 1996；21035-7；Lo YMD等，Lancet 1998；3511329-30及Lo YMD等，Clin Chem 2000；46319-23)。目前虽然对循环核酸的特性和生物学来源所知甚少。然而细胞死亡(包括凋亡)似乎是一个主要的因素(Fournie等，Gerontology 1993；39215-21与Fournie等，Cancer Lett 1995；91221-7)。由于发生凋亡的细胞会将核酸移至凋亡小体中，因此虽然没有理论支持，但人个体血浆或血清中至少部分的循环核酸为颗粒相关性的是有可能的。在此申请中，第一次证明了循环核酸同时以颗粒相关和非颗粒相关形式存在于人体血清或血浆中。同时还证明，通过将个体血浆或血清中的该循环核酸分离为颗粒相关和非颗粒相关形式，可简便和准确地评价疾病的状态。专利技术概述本专利技术提供了评价患者疾病状态的方法，该患者怀疑患有或已知患有此种疾病状态。在本专利技术的一个实施方案中，其包括从怀疑患有或已知患有此种疾病状态的患者中获得血液样本，从血液样本中分离血浆或血清，将所述血浆或血清分成包括颗粒相关和非颗粒相关核酸的不同相对浓度的两个或更多的组分，及通过检测一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性，并将一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性与对照组比较来评价所述疾病状态。本专利技术的一个方面，所述核酸是mRNA。在一个实施方案中，所述mRNA是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA。在第二个实施方案中，所述mRNA是血小板碱性蛋白(PBP)mRNA。在第三个实施方案中，所述mRNA是人胎盘催乳素(hPL)mRNA。在第四个实施方案中，所述mRNA是人绒毛膜促性腺激素β亚基(βhCG)mRNA。本专利技术的第二方面，所述核酸是DNA。在一个实施方案中，所述DNA是线粒体DNA。本专利技术的第三方面，评价怀疑患有或已知患有此种疾病状态的患者中的疾病状态的方法还包括扩增所述核酸的步骤。在一个实施方案中，用PCR扩增所述核酸。在第二个实施方案中，用反转录PCR扩增所述核酸。在第三个实施方案中，用实时PCR扩增所述核酸。在第四个实施方案中，用实时反转录PCR扩增所述核酸。本专利技术的第四方面，通过过滤将血浆或血清分离成两个或更多组分。在一个实施方案中，所述滤膜孔径大小约为5μm或更小。在第二个实施方案中，所述滤膜孔径大小约为0.22μm。在第三个实施方案中，所述滤膜孔径大小约为0.45μm。本专利技术的第五方面，通过离心将血浆或血清分离成两个或更多组分。在一个实施方案中，所述离心为超速离心。本专利技术的第六方面，被评价的所述疾病状态选自癌症、中风及损伤。在一个实施方案中，所述癌症是肝细胞癌或鼻咽癌。本专利技术的第七方面，患者是孕妇，且所述评价患者或其胎儿的疾病或生理状态的方法能够辅助所述患者或其胎儿的检测、监测、预后判断或治疗。本专利技术还提供一种评价患者的疾病状态的方法，所述患者怀疑患有、已知患有或有风险患有肝细胞癌或鼻咽癌。所述方法包括从怀疑患有或已知患有肝细胞癌或鼻咽癌患者中获得血浆或血清，及检测所述样本中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)核酸含量。本专利技术还提供一种评价患者的疾病状态的方法，所述患者怀疑患有或已知患有外伤。所述方法包括从怀疑患有或已知患有外伤患者中获得血浆或血清，及检测所述样本中线粒体核酸含量或浓度。应该理解，不通过从患者中获得样本的步骤，利用先前从患者中获得的样本(如血液样本)，或源自其中的分离样本(如血浆或血清)，也能实施本专利技术的方法。因此，本专利技术可以不包括任何对所述患者直接实施的步骤。还应理解，除非本文中有明确的不同说明，本专利技术的各种方法、方面及实施方案可以进行组合。定义短语“评价疾病的状态”是指对患者的疾病状态进行评估。例如，评价所述患者的状态可包括患者疾病的存在或不存在。当确定患者有疾病存在时，评价所述患者疾病状态可包括鉴定患者疾病的严重程度。其还可包括应用上述鉴定结果对疾病作出预后判断，例如活存时间预测或制定治疗计划。评价患者的所述疾病状态还可包括鉴定患者不再患有疾病，但以往患有该疾病的状态。此时的评价所述疾病的状态还可包括分析该疾病状态的复发率或监测所述患者复发。例如，相互鉴定在几分钟、几小时或几天内发生的两个急性缺血病例。评价所述疾病的状态还包括对患者的疾病信号进行监测。因此评价疾病的状态包括检测、诊断或监测患者疾病的状态，同时确定患者的预后判断和治疗计划。所述评价疾病状态的方法辅助风险分级。血浆是指经抗凝处理后离心血液所得的全血的组分。血清是指血液样本凝集后留下的水样液体部分。本专利技术所使用的短语“将一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性与对照组比较”等同于将一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性与标准品比较。所述短语“将一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性与对照组比较”还可包括组分间的比较。循环核酸同时存在于健康人和疾病患者的血浆或血清中，并同时以颗粒相关和非颗粒相关形式存在。通过将怀疑患有、已知患有或有可能患有疾病患者的颗粒相关和非颗粒相关核酸的相对浓度与健康个体、较早时期的患者样本或另一个已患病个体样本的颗粒相关和非颗粒相关核酸的相对浓度进行比较，可以对疾病的状态进行评价。也可以通过组分间的比较对疾病的状态进行评价。在本专利技术的一些实施方案中，对照组可以不是另一样本，而可由各种个体的数据平均值来代替，该个体被归类为健康或患有不同疾病(例如外伤和癌症)状态。收集的血液中非颗粒相关核酸不同水平或浓度的数据，可对应疾病的严重程度、预后判断或诊断。例如，使用本专利技术的方法，本领域所属技术人员可将一个个体组分A中的非颗粒相关核酸的含量或浓度与对照组比较并确定取样个体是否存在或没有疾病。本领域所属技术人员还可通过比较来确定疾病的类型和阶段。本领域所属技术人员还可通过比较来确定疾病的严重程度或预测患者的存活时间。本领域所属技术人员还可通过比较来辅助对患者的疾病状态进行风险分级、监控或治疗。血浆或血清中的循环核酸能以“颗粒相关”和“非颗粒相关”的两种形式存在。颗粒相关核酸可定义为位于颗粒内部或黏附于或连接到颗粒上或位于颗粒表面的核酸。术语“颗粒”定义为可通过物理手段证实的具有直径为0.1μm～5μm的有限大小的任意物质或经5μm滤膜过滤后再进行超速离心可获得沉淀物的任意物质。直径尺寸超过5μm将包括完整的细胞，因而排除在本专利技术之外。用来确定颗粒相关核酸大小的物理方法包括但不限于离心、超速离心、沉降、过滤、光学显微镜或电子显微镜。相应地，所述术语“颗粒相关核酸”同时包括存在于血浆或血清中的细胞外和细胞内核酸，规定该核酸与大小为0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评价患者的疾病状态的方法，所述患者怀疑患有或已知患有上述疾病，所述方法包括：（ｉ）从所述怀疑患有或已知患有疾病状态的患者中获得血液样本，（ｉｉ）从所述血液样本中分离血浆或血清，（ｉｉｉ）将所述血浆或血清分成包括颗 粒相关核酸和非颗粒相关核酸不同相对浓度的两个或更多的组分，及（ｉｖ）通过检测该一个或更多所述组分中核酸的含量、浓度或特性，并将一个或更多组分中核酸的含量、浓度或特性与对照组比较来评价所述疾病状态。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：卢煜明，吴启安，徐宝贤，赵慧君，陈婉珊，谭伟恩，林毓兰，
申请(专利权)人：香港中文大学，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]