肿瘤易感性增加的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种检测肿瘤易感性增加的方法，该方法是通过特异性检测人的鼠双微体－２（ＭＤＭ２）基因外显子１２的３５４Ａ→Ｇ位置的多态性来实现的。所述多态性是代表人类罹患肿瘤风险增加的遗传性标记物。本发明专利技术还涉及利用所述肿瘤易感性标记物来开发体外及体内检测系统，该系统以特定的方式将所述标记物整合入诊断、预防以及可能的治疗方法中。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测肿瘤易感性增加的方法，该方法是通过特异性检测人的鼠双微体-2(MDM2)基因外显子12的354A→G位置的多态性来实现的。所述多态性是代表人类罹患肿瘤风险增加的遗传性标记物。本专利技术还涉及利用所述肿瘤易感性标记物来开发体外及体内检测系统，该系统以特定的方式将所述标记物整合入诊断、预防以及可能的治疗方法中。
技术介绍
MDM2基因首先在自发性转化的3T3DM小鼠细胞系的双微染色体中被鉴定。已知该基因产物MDM2能够转化小鼠纤维原细胞，从而导致不受控制的、诱发肿瘤的生长。人类的MDM2基因位于12q13-14的染色体片段上，当发现其为肿瘤抑制基因p53的重要的拮抗剂时，其得到了重视。二基因之间的相互调控是通过一个反馈环发生的，即，p53基因活化MDM2基因的转录，而所形成的MDM2基因反过来使得p53蛋白降解。MDM2蛋白对p53显示出泛素连接酶的活性，后者为蛋白体降解的标记。结果达到了对p53蛋白表达的精细调节，而这种调节对胚胎形成是必须的。因此，MDM2基因敲除的小鼠是必死的，但是如果它们不携带有功能性活化的p53基因时，则能够存活。已知MDM2除了与p53肿瘤抑制剂相互作用外，还会影响其它的肿瘤抑制代谢途径，即，Rb-E2F-p16INK4A/p19ARF代谢途径。因此，MDM2可与Rb蛋白结合，阻止Rb介导的G1细胞周期停止，或者直接与转录因子E2F1/DP相互作用并诱导细胞转换进入S期。由于MDM2对两条肿瘤抑制途径都具有负调节作用，而这两条途径对80％的肿瘤都有影响，且许多研究证明，MDM2蛋白具有致肿瘤性(tumourigenic)，因此该基因已经成为基因治疗的一个靶点。概括说来，MDM2的特异性区域能够与诸如p53，CBP/p300，pRb，p73，E2F1，DP1等多种蛋白、核糖体L5核蛋白颗粒、以及p14ARF和RNA等多种物质相互作用。MDM2对于肿瘤发生、细胞周期、以及凋亡等的特殊功能已经在一些综述中进行了讨论(Freedman et al.，1999，Momand et al.，2000，Juven-Gershon and Oren，1999)。特别研究了MDM2在肉瘤(即，来源于间叶细胞的恶性肿瘤)中的作用。在恶性肿瘤中，肉瘤具有对MDM2最高的扩增比率-20～30％。MDM2在转基因小鼠中的过度表达导致了38％的肉瘤发生(与p53的数据无关)。通过multivariate Cox回归分析可以看出，肉瘤患者中MDM2的过度表达使得相关病人的生存率显著降低(Würl et al.，1997)。总的来说，对于MDM2 mRNA或者MDM2蛋白所影响的正常或者肿瘤特异性代谢途径还所知甚少。对基因的功能进行研究的一个途径是分析遗传变异的结果。但是，迄今为止，对于MDM2基因的遗传变异，即，突变或者多态性等，只仅仅进行了很少的研究。对文献的广泛搜索发现，这一主题仅有4篇相关出版物。其中包括对人原发性肿瘤的阴性发现(没有发现基因变化)(Silva et al.，2000)、在MDM2的锌指区域很少发生点突变和插入突变(Schlott et al.，1997)、在5’-未翻译区域的一种多态性(Heighway et al.，1994)、以及在锌指区域外显子10的多态性(Taubert et al.，2000)。这一多态性被确定为专门针对软组织肉瘤(与健康对照受试者的多态性等位基因频率相比较)。该多态性与存活率降低的趋势相关(有多态性的患者的存活率38个月；无多态性的患者的存活率57个月)。本专利技术的目的在于鉴别与肿瘤相关的人MDM2基因的突变或多态性，并确定其与易患病体质(predispositions)的相关性。从这些相关性出发，欲开发出针对这些易患病体质的分子遗传学诊断方法。其目的在于建立一个模型，从而可在外科手术以及药物上都能进行预防以及缓解治疗。本专利技术是基于这样一种认识，即发生在MDM2基因外显子12密码子354上的多态性A→G(GAA→GAG)(NM_002392序列的核苷酸1373)并不局限于软组织肉瘤，而是与多种恶性肿瘤的发病倾向相关，并且，令人惊奇的，该多态性具有遗传特性，即，其保存于胚芽系中。已经发现该多态性与某些上皮来源的实体瘤(前列腺实体瘤)具有相关性的倾向，但其并不局限于这些，它还对更多的实体瘤以及血液肿瘤的易感性具有关键性的作用。本专利技术是按照权利要求书来实现的。本专利技术涉及一种检测肿瘤易感性的方法，该方法的特征在于受试个体的核酸被分离，在外显子12的354位的碱基变换A→G(GAA→GAG)的帮助下，人MDM2基因序列被确定基因型(genotyped)，并且可通过高通量过程对该多态性基因座(在纯合体和杂合体间有区别)的等位基因数据进行高特异性的、且非常敏感的有效确定。可通过测序或其它适宜检测点突变的方法来检测基因分型。这些方法包括PCR所支持的基因分型方法，例如，等位基因特异性的PCR；使用寡核苷酸的其它基因分型方法(例如，点印迹或者寡核苷酸连接试验(OLA))；使用限制性酶的方法以及通过基质辅助的激光离子化脱附游离质谱(MALDI)进行的单核苷酸多态性(SNP)分析；以及理论上用于变异性检测的任意方法，其中包括任意技术方案的基因芯片技术。基于上述研究，本专利技术的方法适于检测广谱的易患不同疾病的体质。在本专利技术的一个实施方案中，该方法通过检测354位的多态性A→G的纯合性或杂合性来作为具有潜在肿瘤易感性的遗传倾向性的标准，尤其适用于患者及其后代的罹患肿瘤的遗传倾向性的标准。在一个优选的突变株中，通过检测多态性的纯合性或杂合性，该方法被用作对上皮组织实体瘤，例如前列腺癌(PCa)、乳腺癌、宫颈癌和/或卵巢癌等的肿瘤易感性的遗传倾向性的标准。该方法尤其适用于检测对前列腺癌的肿瘤易感性。由此为分子生物学诊断专家提供了一个通用的遗传性肿瘤标记物。根据本专利技术，通过检测某一单模标本的纯合性或者杂合性，可以为其遗传倾向提供有价值的陈述。由此可根据分子遗传学提供遗传学建议。此外，该多态性的鉴定可能作为治疗的诊断基础。可利用分离的核苷酸进行检测，也可使用DNA或者RNA。可利用本领域公知的手段将分离的RNA转录为mRNA或者cDNA。此后，对DNA进行测序。根据上述知识，通过使用突变的核苷DNA序列，可以根据本专利技术开发出新的治疗剂，该治疗剂通过调节转录、翻译以及影响其效率而影响MDM2基因的通路并攻击MDM2基因(或与之相关的基因)，优选采用调节表达的方式。影响MDM2基因的一些基因通路是已知的。例如，它们包括·P53-p14·Rb-p161NK4A/p19ARF-E2F·Mdr-1。优选开发出作用于人MDM2基因，并攻击该基因外显子12的354位A→G的治疗剂。此外，本专利技术还开发了体外和体内检测系统。这些检测系统表达外显子12的354位A→G突变的人MDM2基因序列，可将该序列用于检测与MDM2相关的疾病，并且可开发检测个体特异性治疗剂。对本领域技术人员来说，这些检测系统是公知的，它们可以是细胞系、异种移植物、以及其它动物模型等。下面采用对前列腺癌(PCa)的肿瘤易感性的检测为例，对本专利技术进行详细说明，但下述说明并非为了对本专利技术做出限制。对从泌尿道肿瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测对肿瘤具有易感性的方法，其特征在于：分离受试个体的核酸，对人ＭＤＭ２基因，采用外显子１２中３５４位的碱基交换Ａ→Ｇ（ＧＡＡ→ＧＡＧ）进行基因分型，用该方法来确定该多态性基因座的等位基因情况。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：阿克塞尔梅耶，黑尔格陶贝特，蒂莫希勒布兰德，彼得本扎科，卡塔琳娜克吕格尔，马蒂亚斯卡普勒，曼弗雷德维尔特，
申请(专利权)人：英维泰克生物技术和生物设计有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]