本发明专利技术涉及一种检测Ｎ－乙酰－β－Ｄ－氨基葡萄糖苷酶的测定方法及其液体型稳定试剂。其特点是：通过采用固定时间两点法和连续监测法，以稳定的液体试剂实现对体液中Ｎ－乙酰－β－Ｄ－氨基葡萄糖苷酶的自动化测定。底物分解的速率与Ｎ－乙酰－β－Ｄ－氨基葡萄糖苷酶的含量成正比，以固定时间两点法和连续检测法实现体液样本中Ｎ－乙酰－β－Ｄ－氨基葡萄糖苷酶的含量测定。采用本法制备的液体型测定试剂稳定、方便、抗干扰能力强，测定试剂置２－８℃保存可稳定１２个月以上，特别适合进行批量自动化检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶测定方法及其液体型稳定试剂领域。
技术介绍
目前N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在临床应用中的测定方法主要包括放免分析法、荧光分析法、终点显色法等。放免分析法、荧光分析法和终点显色法的共同特点是需要特殊的仪器，操作烦琐，试验时间长，不适用于临床大流量的自动化分析。现在国内测定尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(NAG)活性使用最广的是CPNA连续监测法测定试剂盒(干粉)和PNP固定时间两点法测定试剂盒(干粉+缓冲液)。CPNP连续监测法干粉测定试剂在复溶后，稳定期短(4℃保存只能稳定7天)，用户使用成本高。PNP固定时间两点法测定试剂盒(型号干粉+缓冲液)其测定灵敏度是CPNP连续监测法的三倍，但由于该试剂盒干粉底物非常难溶解，临床实际使用时间十分不便，且干粉底物用缓冲复溶后也只能稳定15天左右。本专利技术的目的是为了解决上述技术的不足，提供一种能够直接使用、无需复溶、稳定性强、测定结果受外界干扰小的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶测定方法及其液体型稳定试剂。该测定试剂置2-8℃保存可至少可稳定12个月，提供的方法和试剂可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于液体试剂稳定技术的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶测定方法及其液体型稳定试剂，用于体液样本中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性的测定。该测定体系主要是通过体液样本中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶作用于对硝基苯-β-D-N-乙酰-氨基葡萄糖苷、间甲氧基硝基乙烯基-β-D-N-乙酰-氨基葡萄糖苷、6-甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-N-乙酰-氨基葡萄糖苷、4-羟甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄糖苷等底物，使底物分解，以固定时间两点法或连续检测法进行测定底物分解速率，实现对样本中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的含量测定。为了达到理想的检测效果与足够的稳定性，本专利技术提供的固定时间两点法N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷检测试剂，特别可以分为A、B、C三个组份；提供的连续监测法N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷检测试剂，特别可以分为A、B二个组份。两种测定试剂的各个组份的具体成份组成如下。1.固定时间两点法N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷检测试剂A组份底物液 5-30mmol/L表面活性剂 0.5-15g/L稳定剂 10-100mmol/L防腐剂 0.5-5g/L去干扰剂 0.1-10mmol/LB组份缓冲液 100-500mol/L防腐剂 0.5-5g/L表面活性剂 0.5-15g/LC组份终止液 50-500mmol/L2.连续监测法N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷检测试剂A组份缓冲液 100-500mmol/L防腐剂 0.5-5g/L表面活性剂 0.5-15g/L去干扰剂 0.1-10mmol/LB组份底物液 5-30mmol/L表面活性剂 0.5-15g/L 稳定剂 10-100mmol/L防腐剂 0.5-5g/L为了提高上述测定试剂的准确性和稳定性，消除测定结果受外界的多种干扰，所述的固定时间两点法测定试剂中优选的底物是硝基苯-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷、间甲氧基硝基乙烯基-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷；连续测法测定试剂中优先的底物是6-甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄糖苷、4-羟甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄糖苷；表面活性剂为Tween20、Tween80、Brij35、Brij98、乳化剂OP、TritonX-100、F68、F-88等非离子型表面活性剂；缓冲液是GOOD’S缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸、醋酸钠缓冲液、柠檬酸、柠檬酸三钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液等；稳定剂是EDTA-2Na、抗生素、多元醇、BSA、冠醚、二价金属离子等；去干扰剂是抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾、亚铁氰化钠、铁氰化钾等；防腐剂是NaN3、PC系列防腐剂等。具体实施例方式实施例1固定时间两点法测定试剂，选用对硝基苯-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷为NAG作用的底物，表面活性剂优选为F88，稳定剂优选为EDTA-2Na。A组份对硝基苯-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷 20mmol/LF88(表面活性剂) 5g/LEDTA-2Na(稳定剂) 50mmol/LNaN3(防腐剂) 1g/L坏血酸氧化酶(去干扰剂)8mmol/LB组份pH4.6柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液 50mmol/LNaN3(防腐剂) 1g/LF88(表面活性剂) 5g/LC组份NaOH(终止液) 100mmol/L 在实施例1的试剂用于测定前，将A组份和B给份按5∶1的比例混合为测定试剂R1，C组份为测定试剂R2。测定样本时，采用固定时间两点法，温度为37℃，R1样本R2为300∶20∶100，测定波长为405nm-410nm，R1加入样本或标准后在测定温度孵育300秒后读取第1点吸光度，然后加入R2继续孵育150-300秒后读取第2点吸光度。实施例2固定时间两点法测定试剂，选用间甲氧硝基乙烯基-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷为NAG作用的底物，表面活性剂优选为乳化剂OP，稳定剂优选为甘露醇。A组份间甲氧基硝基苯-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷16mmol/L乳化剂OP 10ml/L甘露醇12g/LPC800 1g/L坏血酸氧化酶 8mol/LB组份pH4.4甘氨酸缓冲液80mmol/LPC800 1g/L乳化剂OP 10ml/LC组份PH10.0硼砂缓冲液 100mmol/L实施例2的测定方法与实施例1相同，但测定波长调整为505nm，以便有效地提高测定试剂的灵敏度和抗干扰能力。实施例3连续监测法测定试剂，选用6-甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄苷为NAC作用的底物，表面活性剂优选为Brij35，稳定剂优选为18-冠5醚。A组份PH4.4醋酸-醋酸纳缓冲液 200mmol/LPC800 1g/LBrij358g/L 亚铁氰化钾 1mmol/LB级分6-甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄苷12mmol/LBrij35 8g/L18-冠5醚 200mmol/LPC8001g/L实施例3的试剂用于测定时，试剂无需配制直接使用，A组份为测定试剂R1，B组份为测定试剂R2。测定样本时，采用连续监测法，温度为37℃，R1∶样本∶R2为300∶20∶100，测定波长为340nm，R1加入样本或标准后在测定温度孵育180秒后加入R2，延迟120秒开始读数，连续读取180秒吸光度的变化，用于计算样本中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活性。实施例4连续监测法测定试剂，选用4-羟甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄糖苷为NAG作用的底物，表面活性剂优选为TritonX-100，稳定剂优选为18-冠5醚和EDTA-2Na的组合。A组份pH4.5邻苯二甲酸氢钾缓冲液 150mmol/LPC8001g/LTritonX-100 2ml/L铁氰化钾 1mmol/LB组份4-羟甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测Ｎ－乙酰－β－Ｄ－氨基葡萄糖苷酶的测定方法，其特征在于：所述的固定时间两点法测定试剂底物，是基硝基苯－β－Ｄ－Ｎ－乙酰氨基葡萄糖苷、间甲氧基硝基乙烯基－β－Ｄ－Ｎ－乙酰氨基葡萄糖苷；连续监测法测定试剂，底物是６－甲基－２－吡啶－Ｎ－乙酰－１－硫－β－Ｄ－氨基葡萄糖苷、４－羟甲基２－吡啶－Ｎ－乙酰－１－硫－β－Ｄ－氨基葡萄糖苷；表面活性剂为Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ９８、乳化剂ＯＰ、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｆ６８、Ｆ－８８等非离子型表面活性剂；缓冲液是ＧＯＯＤ’Ｓ缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸－醋酸钠缓冲液、柠檬酸－柠檬酸三钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾－盐酸缓冲液等；稳定剂是ＤＥＴＡ－２Ｎａ、抗生素、多元醇、ＢＳＡ、冠醚、二价金属离子等；去干扰剂是抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾、亚铁氰化钠、亚铁化钾等；防腐剂是ＮａＮ↓［３］、ＰＣ系列防腐剂等。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：商纯尔，
申请(专利权)人：商纯尔，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]
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