本发明专利技术提供了快速定量检测肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）的遗传标记和方法，具体地，本发明专利技术提供了肺炎支原体Ｐ１细胞粘附蛋白基因（Ｐ１ ＣｙｔａｄｈｅｓｉｎＧｅｎｅ）的核苷酸序列，以及以该序列为基础设计的寡核苷酸引物和探针。本发明专利技术还提供了用这些引物快速特异性检测肺炎支原体的方法。本发明专利技术可方便、快速、准确地定性检测和定量计数肺炎支原体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和核酸检测领域，特别涉及一种利用聚合酶链式反应扩增P1细胞粘附蛋白基因(P1 Cytadhesin Gene)从而高灵敏度地特异检测临床样本中的肺炎支原体的方法及利用该方法获得的实时荧光PCR检测试剂盒。
技术介绍
支原体肺炎是一种非常严重的传染性疾病，在肺炎中，支原体肺炎约占15％～20％，并且导致多种并发症。支原体肺炎是由肺炎支原体引起的急性肺部感染。肺炎支原体能侵犯任何年龄人群的呼吸系统，此外还对人体的其他多个系统致病，临床表现复杂。近年来，肺炎支原体感染患者增多，因此肺炎支原体对人类的危害日益受到重视。要消灭肺炎支原体需多方努力如发展快速诊断方法、研制新药、进行分子机制研究和疫苗研究等，其中发展快速诊断方法最为紧迫。由于肺炎支原体生长缓慢，通过培养患者的标本来鉴定肺炎支原体需要2～3周的时间，因此培养法对临床帮助不大。为了更快地检查出标本中的肺炎支原体从而能在早期阶段治疗支原体肺炎，需要开发利用聚合酶链式反应(PCR)对肺炎支原体的核酸进行扩增检测。近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，特异性好，速度快等优点在基因表达水平分析、病原体的定性检测和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法。国内目前也已有关于乙肝、艾滋病、结核定量检测的试剂盒上市。对于聚合酶链式反应来说，选择待扩增的靶DNA的碱基序列是最为重要的。针对肺炎支原体，这个碱基序列必须为肺炎支原体特异拥有并且不能存在于人类DNA及可能发生合并感染的其他物种中。许多研究者已经报道了类似的碱基序列。具有代表性的是原核生物中高度保守基因序列的16S rRNA。16S rRNA基因的大小为1500碱基对左右，具有(1)保守性高，在生物进化中比其他基因演变得慢，有“分子化石”之称；(2)保守性是相对的，不同科、属、种间都有不同程度的差异；(3)不能侧向转移；(4)大小适度，能满足进行比较、扩增的要求。所以，通过聚合酶链式反应扩增检测肺炎支原体，16S rRNA基因具有一定优势。因此，16S rRNA基因一直被广泛应用为聚合酶链式反应的靶序列。然而据最近的报道，肺炎支原体和生殖支原体的16S rRNA序列极为相近，在此基础上设计的引物，肺炎支原体和生殖支原体均会高效扩增。临床检测中，肺炎支原体感染患者的样本中经常发现混合有生殖支原体，所以为了能准确区分二者，有必要寻找另外的肺炎支原体特异的碱基序列。因此，本领域迫切需要开发新高特异性地检测肺炎支原体的方法和试剂盒，以便能够既有效检测肺炎支原体，又可有效区别肺炎支原体和生殖支原体。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种既有效检测肺炎支原体，又可有效区别肺炎支原体和生殖支原体的方法和试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供一种检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的遗传标记物，它具有SEQ ID NO1中连续的70-300个核苷酸。在另一优选例中，所述的遗传标记物具有SEQ ID NO2中第1-160位中连续的160个核苷酸。在本专利技术的第二方面，提供了一种检测肺炎支原体的试剂盒，它含有特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且一个引物的序列与SEQ ID NO1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO1所示的序列互补，且扩增产物的长度为70-300bp。在另一优选例中，所述的试剂盒还含有探针，所述探针的长度为20-50bp，且该探针的序列与SEQ ID NO1所示的序列相同或互补。在另一优选例中，所述引物对中的一个引物选自下组SEQ ID NO3或6；另一个引物选自下组SEQ ID NO4或7；并且所述的探针是Taqman探针，其序列选自下组SEQ ID NO5或8。在另一优选例中，该试剂盒还包括a)DNA裂解液，b)荧光定量反应液，c)定量校准品，d)阳性对照品，e)阴性对照品。在本专利技术的第三方面，提供了一种检测样品中肺炎支原体的方法，它包括步骤(a)抽提样品的DNA；(b)将抽提的DNA作为模板，用特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对进行PCR扩增，其中所述的引物长度为15-35个核苷酸，一个引物的序列与SEQ IDNO1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO1所示的序列互补；(c)检测扩增产物是否存在，存在扩增产物就表示样品中存在肺炎支原体。在另一优选例中，所述的步骤(c)是通过检测荧光信号的强弱来定量检测样品中的肺炎支原体。在本专利技术的第四方面，提供了一种支原体P1细胞粘附蛋白基因的用途，它被用作体外检测肺炎支原体是否存在的遗传标记物。在另一优选例中，P1细胞粘附蛋白基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。具体实施例方式本专利技术人经过深入而广泛的研究，从肺炎支原体中发现的一段新的约5000个碱基对的基因-P1细胞粘附蛋白基因(P1 Cytadhesin Gene)(J.WENDELIENDORIGO-ZETSMA，INFECTION AND IMMUNITY，Sept.2001，p.5612-5618)中发现较合适的扩增序列。该基因为肺炎支原体本身特有的功能性基因序列，所编码的结构蛋白称为粘附蛋白。P1细胞粘附蛋白集聚于菌体顶端的突出部分，与肺炎支原体粘附宿主细胞有关，甚至可能与其致病性有关；另外，P1细胞粘附蛋白的抗原性可引起被感染宿主的抗体反应。因此，选择这一特定结构性、功能性蛋白的核酸序列作为引物，具有很好的特征性。如本文所用，术语“P1 Cytadhesin Gene”或“P1细胞粘附蛋白”指编码肺炎支原体P1细胞粘附蛋白的核苷酸序列，其GenBank登录号M18639，具体序列示于SEQ ID NO1。根据P1细胞粘附蛋白基因设计的引物可在肺炎支原体的标准株及临床标本中扩增出相应的DNA片段。而且，该引物未在其他相关支原体(如生殖支原体)上扩增出相应片段，说明以P1细胞粘附蛋白基因为基础设计的PCR反应系统具有良好特异性。就敏感性而言，P1细胞粘附蛋白基因由重复序列RepMP2/3和RepMP4组成，二者在基因组中分别为10个拷贝和8个拷贝。当以此序列为基础设计引物并对对肺炎支原体患者的临床标本进行PCR扩增时，结果显示其敏感性等同于16SrRNA基因。P1细胞粘附蛋白基因在肺炎支原体仅有的两个型中均存在。对两个型共6株的P1细胞粘附蛋自基因分别测序，随后的同源性比较结果表明两型的P1细胞粘附蛋白基因序列高度保守，并且主要的差异区域集中在相近位点。虽然通过同源比较，P1细胞粘附蛋白基因的全长基因中有多个区域作为合适的特异性标志区域，然而SEQ ID NO2所示的核苷酸序列是一种特别优选的适合作为肺炎支原体特异性遗传标志的序列。因此，基于SEQ ID NO1和2，本专利技术提供了一种利用聚合酶链式反应扩增P1细胞粘附蛋白基因检测肺炎支原体的方法；还提供一种快速定量检测肺炎支原体的荧光定量PCR试剂盒。其中的关键是使用了特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且一个引物的序列与SEQ IDNO1所示的序列相同，且另一个引物的序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测肺炎支原体的遗传标记物，其特征在于，它具有ＳＥＱＩＤＮＯ：１中连续的７０－３００个核苷酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李超，周煜，夏懿，
申请(专利权)人：上海复星医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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