精神分裂症关联基因制造技术

本发明专利技术提供一个与精神分裂症的发生密切相关的精神分裂症关联基因，即序列长度为８５５６９ｂｐ的ＰＰＡＲＤ基因。由于该基因的单核苷酸多态性ｒｓ２０７６１６９碱基Ｔ突变为Ｃ，从而与精神分裂症的易感性相关联。ｒｓ２０７６１６９碱基为Ｃ的个体为精神分裂症的易感人群，ｒｓ２０７６１６９碱基为Ｔ的个体不易发生精神分裂症。ＰＰＡＲＤ基因及其编码蛋白对阐明精神分裂症遗传学机制及建立基因诊断方法，指导精神分裂症预防、开发新型治疗药物具有重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一个与精神分裂症有显著关联的易感基因。
技术介绍
精神分裂症是最严重的精神疾病之一。在我国，精神分裂症的终身患病率高达0.7％。这样大的患病群体，不仅给家庭和社会带来沉重的经济负担，而且还严重威胁社会的安全与稳定。因此，确定精神分裂症的病因，建立有效地防治方法，已成为医学界乃至整个社会需迫切解决的问题。精神分裂症与遗传因素有密切关系，且归类于多基因遗传病。人类基因组系统扫描发现，除19号、21号和Y染色体外，其余染色体上都可能含有精神分裂症易感基因。利用连锁和关联方法定位精神分裂症的易感基因已成为分子遗传学研究的热点。StraubRE等最早报道6p区域可能存在精神分裂症易感基因(Straub RE，et al.NatGenet，1995，11287-293)。Schwab SG等人亦发现在10号和6号染色体存在精神分裂症易感基因(Schwab SG，et al.Mol Psychiatry，2000，5638-649)。但至今在该染色体区域内未发现确定特异的与精神分裂症有关的易感基因。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是在第6号染色体区域内揭示精神分裂症关联基因；目的之二是通过该易感基因遗传特性提出一种判定精神分裂症的易感人群的方法，以利于指导精神分裂症的预防和治疗。本研究结果表明PPARD是精神分裂症的易感基因，序列长度为85569bp。由于该位点的单核苷酸多态性rs2076169碱基T突变为C，从而与精神分裂症的易感性相关联。PPARD基因位于6p21.1染色体区域，由这个基因所编码的蛋白是过氧化物酶激活型增殖体受体(PPAR)家族的一个成员。PPARs是核激素受体，结合过氧化物酶增殖体通过细胞控制过氧化物酶体的大小和数量。PPARs介导多种生物反应过程，并且可能参与几种慢性疾病的发生，包括糖尿病、肥胖、动脉硬化以及癌症。这个蛋白是PPAR-δ和PPAR-γ配体介导转录活性的有效抑制剂，它的功能可能是作为转录抑制和核受体信号的综合体。在结肠癌细胞中发现PPARD基因表达升高，这种表达升高可以被APC(adenomatosis polyposis coli)所抑制，APC是一种肿瘤抑制蛋白与APC/beta信号通路有关。小鼠的基因敲除实验表明，PPARs对胼胝体的髓鞘形成、脂质代谢和表皮细胞的增殖均起重要作用。本专利技术在6p21区通过连锁不平衡分析方法进行单个核苷酸多态性(SNP)连锁不平衡制图分析，通过NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapviewer)数据库，获得6p21内所有侯选基因，并获得PPARD基因序列。通过http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP及http//snp.cshl.org/数据库，在PPARD基因上选择含有限制性酶切位点的单核苷酸多态性rs2076169。下列所示为这个单核苷酸多态性的核苷酸序列。加黑部分分别为引物序列，方框内是发生互换的碱基，划线处则是Hinf I限制性内切酶识别的酶切位点，箭头所示内切酶的切割部位。具体信息如下。SNPrs2076169 Gene bank accession numberAY442342，Base changeC/TGGTAACATAAGATTGTCTCACGGCTAACTTGATTTCTTCATAAATGTATCTGGTTCTGTGTATTTGTGAGGTGGTGATTCAATAAAATAATCTGTGA TGATGGGTGTGAAGTTAGGAAGGACCCACAAATATCACTGGAAAAACAAATGTCTGTCCTTTTTTCTCAGAGCCCGCTTTGAGCCTTGAGAAACAAGAAACCCAGACCTCAGGTAAGACGATGGCTCAGCC以中国东北地区255个汉族精神分裂症患者和他们健康父母双亲组成的核心家系(Trios)为研究对象。患者均于2000-2004年间入院，按国际疾病分类标准第10版(ICD-10)被诊断为精神分裂症。这种基于家系的研究，系以父母双亲传递给患病子女的等位基因为“病例”，以未传递的等位基因为“对照”。因病例与对照等位基因均来自同样的基因池，可避免人群层化问题。家系成员均由外周静脉抽取抗凝血5ml，用星普液体微量DNA提取试剂盒(宁波)提取基因组DNA。步骤如下①取血样100μl，加入到1.5ml离心管中，然后加入100ul的1×TE缓冲液，摇匀；②一边振荡，一边加入200μl的B1试剂，充分混匀；③在振荡中加入200μl的B2试剂，充分混匀；④将混合溶液移入旋转离心柱中离心(14000rpm，分钟)；⑤向旋转离心柱中加入400μl的B3试剂后离心(14000rpm，1分钟)；⑥重复上述步骤；⑦空柱离心(14000rpm，2分钟)，将旋转离心柱移入干净的1.5ml离心管中，加入100μl的B4试剂离心(14000rpm，1分钟)；此时离心管中的溶液体积为100μl，含有已经提取的基因组DNA。使用美国BECKMAN公司生产的型号为Du640紫外分光光度仪，分别取波长260nm、280nm两个波段，测得其相应DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通过公式，计算出DNA含量，公式为DNA含量＝50mg/ml×OD260nm×稀释倍数，另外通过公式计算出DNA纯度，公式为DNA纯度＝OD260nm/OD280nm。依据相应的碱基序列合成引物。rs2076169为GGTAACATAAGATTGTCTCACGG和GGCTGAGCCATCGTCTTACCTG。PCR反应体系为20μl，其中含10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mMMgCl2，0.001％(w/v)gelatin，200μM of each dNTP，上下游引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U，DNA模板30-50ng。PCR扩增条件为①94℃5min②96℃45s，60℃60s，72℃60s 3个循环；③95℃45s，58℃60s，72℃60s 5个循环；④94℃45s，56℃60s，72℃60s 32个循环；⑤72℃10min。取PCR产物5μl用1.5％琼脂糖凝胶电泳，以DNAmarker DL2000为分子量标准品。所扩增的片段长度为233bp。在PCR扩增后的反应体系中，加入适量相对应的限制性内切酶及其酶切缓冲液，置37℃温箱5小时。经3.5％琼脂糖凝胶电泳，根据酶切图谱判断基因型。存在3种基因型，其中有完全切开的纯合基因型，未切开的纯合基因型，既有切开又有未切开的杂合基因型。建立Pedigree和SPSS SNP基因分型数据库(参见表1和表2)，应用拟合优度卡方检验和传递不平衡检验，应用UNPHASED分析软件进行单倍体传递卡方检验，利用SPSS软件管理数据。表1 Pedigree数据库格式 表2 SPSS数据库格式 传递不平衡检验(Transmitted disequi1ibrium test，TDT)显示SNP rs2076169与精神分裂症显著关联(x2＝14.961，P＝0.00011)。在233个家系466个父母中，154个为杂合子，而这些杂合父本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个精神分裂症关联基因，是序列长度为８５５６９ｂｐ的ＰＰＡＲＤ基因，由于该基因的单核苷酸多态性ｒｓ２０７６１６９碱基Ｔ突变为Ｃ，从而与精神分裂症的易感性相关联。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠桂芝，尉军，孙世龙，刘树铮，于雅琴，史杰萍，谢林，张萱，郭英君，许琪，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]