用于表达基因检测的信号扩增方法技术

本发明专利技术提供一种用于表达基因检测的信号扩增方法，不需要高价的酶，而能够低成本、容易操作、在短时间内进行检测，另外由于不使用线性扩增法或ＰＣＲ法，可以根据原来ＲＮＡ的长度、表达量进行检测。所述方法是利用逆转录反应以及通过寡核苷酸.探针的自集合形成自集合体的自集合反应，使ＤＮＡ芯片的表达基因的检测灵敏度提高的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及，更详细地讲，涉及利用通过寡核苷酸引起的自集合反应，可以使检测灵敏度提高，根据靶RNA的长度以及表达量来检测目的基因的。
技术介绍
通常，使用DNA芯片的表达基因的检测，使用只含有聚dT的引物或随机引物，通过逆转录反应，将整合了用Cy3或Cy5等荧光物质标记的核酸的标记cDNA作为探针。另外，对于微量的样品，一般是使用线性扩增法合成反义RNA(参照例如林崎良英监修，“DNA微阵列实用手册”羊土社、2000年12月1日，p.80-90)。然而，线性扩增法是第1链cDNA合成后，使用RNaseH、DNA聚合酶I、DNA连接酶3种酶，合成第2链cDNA，最终通过RNA聚合酶进行体外转录反应，对反义RNA进行扩增的方法，但存在着必须用多种高价的酶，在其操作上也非常烦杂的缺点。另外，当样品为极微量时，必须要重复多次进行该线性扩增法。存在着通过线性扩增法得到的反义RNA有变得比原来RNA短的倾向，不能正确反映原来RNA长度的问题。另外，本专利技术人等报告了不使用酶的新的等温核酸扩增法(参照例如美国专利第6,261,846号公报、专利第3267576号公报、以及欧洲专利申请公开第1,002,877A号说明书)。该方法是使用由3处区域构成的一对寡核苷酸(HoneyComb Probe，以下称为HCP)的方法，在碱基序列上想办法使得第1HCP和第2HCP的各3处区域含有彼此互补的碱基序列，当使两者反应时，只与区域中的一处进行杂交。通过这样的办法，使许多的成对的HCP反应时，彼此进行杂交，通过HCP的自集合反应而形成集合体(Probe alternation link self-assembly reaction，以下将通过该HCP的自集合反应形成集合体的形成法称为PALSAR法)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供不需要高价的酶，而能够低成本、容易操作、在短时间进行检测，另外由于不使用线性扩增法或PCR法，可以根据原来RNA的长度以及表达量进行检测的。为了解决上述课题，本专利技术的的第1方式特征是利用逆转录反应以及通过寡核苷酸·探针的自集合形成自集合体的自集合反应，使DNA芯片、DNA微阵列、微孔或球状珠(在本专利技术中，将DNA芯片、DNA微阵列、微孔或球状珠总称为DNA芯片)的表达基因的检测灵敏度提高。本专利技术的的第2方式特征是作为利用逆转录反应以及通过寡核苷酸·探针的自集合形成自集合体的自集合反应，使DNA芯片的表达基因的检测灵敏度提高的方法，包括用在3’末端含有聚dT，而且含有与上述寡核苷酸·探针可进行杂交的区域的第1探针作为引物，进行mRNA的逆转录反应，使含有cDNA区域的第2探针形成的工序；使上述mRNA从上述第2探针解离的工序；使上述第2探针与含有靶mRNA的cDNA区域互补区域的捕捉用探针杂交的工序；以及通过使用上述第2探针和上述寡核苷酸·探针的自集合反应形成自集合体的工序。在进行通过上述自集合反应形成自集合体的工序的阶段，没有特别限定，最好是在使上述第2探针与上述捕捉用探针杂交的工序后进行。作为上述自集合反应，第1可以使用如下所述的自集合反应，即，使用多对彼此互补的碱基序列区域由n(n≥3)处数构成的一对寡核苷酸·探针，使得它们交错地进行交叉那样杂交，寡核苷酸自集合，使双链的自集合体形成。作为上述自集合反应，第2可以使用如下所述的自集合反应，即，具有下述第1系和第2系，所述第1系是包含多对在将No.1和No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分为3′侧区域、中央区域以及5′侧区域3个区域，以各寡核苷酸的中央区域作为彼此互补的碱基序列形成二聚体探针的同时，以3′侧区域和5′侧区域作为彼此非互补的碱基序列的一对二聚体形成用探针的第1系，所述第2系是包含多对在将No.3和No.4的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分为3′侧区域和5′侧区域2个区域，以各寡核苷酸的3′侧区域以及5′侧区域作为彼此非互补碱基序列的一对交联探针的第2系，使该交联探针形成对由该二聚体形成用探针形成的二聚体可进行交联的碱基序列，通过使该探针杂交，寡核苷酸自集合，形成自集合体。可以使上述探针的碱基序列形成为分别使第1系的No.1-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的3′侧区域、第1系的No.2-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的5′侧区域、第2系的No.4-寡核苷酸的3′侧区域和第1系的No.2-寡核苷酸的3′侧区域、第2系的No.3-寡核苷酸的5′侧区域和第1系的No.1-寡核苷酸的5′侧区域互补的碱基序列。可以使上述探针的碱基序列形成为分别使第1系的No.1-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的3′侧区域、第1系的No.2-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的5′侧区域、第1系的No.2-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的3′侧区域、第1系的No.1-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的5′侧区域互补的碱基序列。本专利技术的的第3方式特征是作为利用逆转录反应以及使用彼此互补的碱基序列区域由n(n≥3)处数构成的成对寡核苷酸·探针即第1HCP以及第2HCP的许多对、通过使它们交错地进行交叉那样杂交、寡核苷酸自集合形成自集合体的自集合反应，使DNA芯片的表达基因的检测灵敏度提高的方法，使在3’末端含有聚dT，而且至少含有一部分上述第1HCP的碱基序列区域的第1探针与mRNA结合，使用逆转录酶进行逆转录反应，使至少含有一部分cDNA区域和上述第1HCP的碱基序列区域的第2探针形成，除去mRNA后，使上述第2探针与含有与靶mRNA的cDNA区域互补的区域的捕捉用探针杂交，添加上述第1HCP和上述第2HCP或上述第2HCP，通过寡核苷酸的自集合反应使自集合体形成，使信号扩增。在本专利技术的信号扩增方法中，作为靶表达基因可以使用末端含有聚A的mRNA。上述DNA芯片具有结合用于捕捉靶基因的捕捉用探针的支撑体，作为该支撑体，优选使用微滴板型、载玻片型、微粒子型、或导电性基板型等支撑体。对于上述微滴板型和微粒子型支撑体的材质可以使用塑料或聚苯乙烯等。而在载玻片型支撑体中可以使用玻璃或塑料等材料。对于导电性基板型支撑体可以使用金电极或ITO电极(indium oxide)等。对于上述自集合体，通过使标记探针杂交，可以进一步检测上述自集合体的存在。上述标记探针优选为用发色系酶、发光系酶、或放射性同位素标记的标记探针。对于上述自集合体，添加具有可与核酸结合的性质的荧光物质，可以通过该荧光物质的光化学上的变化检测上述自集合体的存在。用荧光物质预先对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，可以通过荧光物质的光化学上的变化检测上述自集合体的存在。用放射性同位素预先对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，可以通过放射性同位素检测上述自集合体的存在。用发色系酶或发光系酶预先对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，可以通过光化学上的变化检测上述自集合体的存在。上述寡核苷酸是由选自DNA、RNA、PNA或LNA中任一个的碱基构成。附图说明图1是表示本专利技术的信号扩增方法的工序顺序的一例的流程图。图2是从原理上表示本专利技术的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤200的模式图。图3是从原理上表示本专利技术的信号扩增方法的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于表达基因检测的信号扩增方法，其特征在于，利用逆转录反应和通过寡核苷酸.探针的自集合形成自集合体的自集合反应，使ＤＮＡ芯片的表达基因的检测灵敏度提高。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：薄井贡，藤川利彦，
申请(专利权)人：卫材株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]