本发明专利技术涉及一种呼吸道病原体的实时荧光聚合酶链式反应检测方法及其试剂盒。其方法特征在于，对ＧｅｎＢａｎｋ中登录的相关的呼吸道病原体（包括Ａ型流感病毒，Ｂ型流感病毒，呼吸道合胞病毒，肠道病毒，腺病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体）的基因组核酸序列进行分析，根据各种病原体特异性和保守性高的碱基的聚集区域设计引物和探针；使用本发明专利技术所提供的试剂盒，从咽拭子样品提取病原体核酸；在引物和探针的存在下，在荧光ＰＣＲ仪中，对提取的病原体核酸进行ＰＣＲ扩增或ＲＴ－ＰＣＲ扩增，从而实现呼吸道病原体的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及七种呼吸道传染病的病原体实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法及其试剂盒。这七种病原体包括A型流感病毒(Influenza.A)，B型流感病毒(Influenza.B)，呼吸道合胞病毒(RSV)，肠道病毒(EV)，肺炎支原体(MP)，肺炎衣原体(CP)，呼吸道腺病毒(ADV)。
技术介绍
呼吸道病原体主要通过呼吸道侵入人体，并随呼吸道分泌物向外传播，侵入另一易感机体引起呼吸道传染性疾病。呼吸道病原体主要通过空气(飞沫、尘埃)传播，而目前尚缺乏有效的大面积空气消毒方法，故其预防重点在于早期发现和在流行前的预防。呼吸道病原体主要包括病毒、致病菌、支原体、衣原体等。主要有Influenza.A，Influenza.B，RSV，EV，M.P，C.P，ADV等。呼吸道传染病的临床表现不特异，上呼吸道感染性疾病的症状主要包括咳嗽、流涕、咽喉不适等呼吸道局部症状和发热、乏力、头痛、肌肉酸痛等全身症状；下呼吸道感染性疾病的初期可见咳嗽、鼻塞等非特异的临床表现。多种病毒性肺炎之间依靠临床症状几乎无法区别，其和衣原体肺炎、支原体肺炎鉴别也比较困难。临床上常用的血液学检查、影像学检查等在相当程度上不能确定所感染的病原体。由于呼吸道传染病的临床表现和常用的辅助检查缺乏明显的特异性，因此存在着在疾病早期病原体诊断不明确的危险因素，从而存在着疾病早期滥用抗生素、生病期延长而增加患者痛苦和经济负担的客观因素。实时荧光PCR检测方法采用特异性的核酸序列进行呼吸道传染病的病原学诊断，有利于在疾病症状出现的早期就确定引起呼吸道传染病的病原体。有利于在疾病早期针对性进行有效的抗生素治疗，缩短呼吸道传染病的病程，减轻患者的痛苦和经济负担。对呼吸道传染病及时而准确的病原学诊断，有利于对呼吸道传染病的流行病学进行研究，指导在疾病流行的初期进行预防，从而能极大程度的降低呼吸道传染病的流行范围和程度，降低呼吸道传染病对社会的危害。流行性感冒曾发生过多次全球性大流行，第一次世界大战末期(1918～1919)的流行，导致5亿人患病，死者2000万；1946～1947年、1957～1958年与1968～1969年又曾三度流行于全世界，之后由于传染病的预防和控制体制和机构的不断健全，从而极大程度的控制了流感的流行。然而对于一些易感群体(如老人，儿童等)，呼吸道传染病的发病率仍然居高不下，据2004年WHO的报告显示，发展中国家临床肺炎的发病率为0.29次/儿童-年(e/cy)，全球95％以上低龄儿童的临床肺炎发生在发展中国家。目前临床上常用的呼吸道病原体的检测方法主要是通过检测特异性抗体的方法进行的。由于病原体从进入机体进行复制和抗原刺激到产生抗体需要一定的时间，这种方法仍不能满足早期病原体确诊的需要，从而不能满足早期进行积极治疗的临床需要。荧光实时PCR检测方法通过不同病原体的特异性核酸序列，来对呼吸道传染病进行病原学诊断，在疾病发生发展的早期就可以进行诊断，从而具有显而易见的临床诊断意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种常见呼吸道病原体的早期、有效而简便的检测方法，涉及的病原体包括A型流感病毒(Influenza.A)，B型流感病毒(Influenza.B)，呼吸道合胞病毒(RSV)，肠道病毒(EV)，肺炎支原体(MP)，肺炎衣原体(CP)，腺病毒(ADV)。本专利技术的另一目的在于提供用于该方法的试剂盒。本专利技术在大量分析现有的在GenBank登录的上述七种呼吸道病原体不同型别的基因组全序列的基础上，找出这七种病原体各自所特异的核酸序列，并根据不同病原体的型别，设计了对各自病原体的大多数型别都具有较高灵敏度的特异性引物和探针，提高了临床检测的特异性和灵敏度；这种检测方法同荧光实时PCR相结合，同时发挥了实时荧光PCR检测方法快速简便的性能，实现了本专利技术的目的。本专利技术的七种呼吸道病原体的实时荧光PCR检测方法的技术特征在于，对GenBank中的相关序列进行分析，找出特异性和灵敏度都较高的核酸序列，并使用相关软件分析并设计引物和探针，利用引物、探针序列的特异性，结合荧光PCR的方法，从咽拭子中提取出呼吸道病原体的核酸，进行PCR扩增实现临床样本中病原体的检测。对于该检测方法所配套的试剂盒，所采用的探针和引物的设计顾及到了几乎所有的型别，探针和引物所选择的是核酸片段具有明显的属特异性。所设计的探针采用荧光素FAM(Carboxyfluorescein，羧基荧光素，吸收波长492nm，发射波长518nm，绿色)作为发光基团，采用MGB(Miner groove binder)或BHQ1(Black Hole Quencher 1)作为淬灭基团，所设计的引物都可以采用相同的退火温度55℃。所涉及的七种待检病原体的核酸序列片段分别为A型流感病毒(Influenza.A)CTGGGAATGCTGAAATTGAAGATCTCATTTTTCTGGCACGGTCTGCACTAATCCTGAGAGGATCAGTGGCCCACAAGTCCTGCTTGCCTGCTTGTGTGTACGGACTTGCAGTGGCCAGTGGATATGAB型流感病毒(Influenza.B)CCAGGGATTGCAGACATTGAAGATCTAACCCTGCTTGCTCGTAGCATGGTCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGAGCAAAGTAGTTCTTCCCATAAGCATTTACGCCAAAATACCTCAACTAGGGTTCAATGTTGAAGAGTACTCTATGGTTGGGTACGAAGCCA呼吸道合胞病毒(RSV)TGAACAACCCAAAAGCATCATTATTATCTTTGACTCAATTTCCTCACTTCTCCAGTGTAGTATTAGGCAATGC肠道病毒(EV)GGCTAATCCTAACTGCGGAGCAGGTACCCACGAGCCAGTGGGCAGCCTGTCGTAATGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCATTTACTCTTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATCACGGAATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATC肺炎支原体(MP) CCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCAATGCCGCGTGAACGATGAAGG TCTTTAAGATTGT肺炎衣原体(CP)TGAAGTCGGAATTGCTAGTAATGGCGTGTCAGCCATAACGCCGTGAATACGTTCTCGGGCCTTGTACACAC腺病毒(ADV)ATGGCCACCCCATCGATGATGCCCCAATGGGCATACATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGG所涉及的七种待检病原体的引物和探针的序列分别为A型流感病毒引物1TGGCACGGTCTGCACTCA引物2GTACACACAAGCAGGCAAGCA引物3CTGGGAATGCTGAAATTGAAGATC引物4TCATATCCACTGGCCACGGCAAG探针FAM-CCTGAGAGGATCAGTGGCCCACA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种呼吸道病原体的实时荧光聚合酶链式反应检测方法，包括以下步骤：ａ．根据七种病原体的待检靶基因特异性核酸序列设计特异性的引物；ｂ．根据七种病原体的待检靶基因特异性核酸序列位于引物之间的序列设计，合成各自的荧光探针；ｃ ．使用步骤ａ中的引物和步骤ｂ中的探针及其他ＰＣＲ或ＲＴ－ＰＣＲ成份组成ＰＣＲ或ＲＴ－ＰＣＲ反应液；ｄ．从待检样本中提取ＤＮＡ或ＲＮＡ，加入到ＰＣＲ主反应液或ＲＴ－ＰＣＲ主反应液中；ｅ．将反应管放在自动荧光ＰＣＲ仪中进行检测； ｆ．检测程序结束后，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）和基线（Ｂａｓｅｌｉｎｅ），使仪器给出正确的结果，进行结果判断。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周荣，黄茜华，王海，
申请(专利权)人：广州华银医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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