大麦脂肪加氧酶-1基因、大麦的筛选方法、麦芽酒精饮料用原料及麦芽酒精饮料的制造方法技术

以通过大麦脂肪加氧酶－１基因第５内含子剪切位点的鸟嘌呤是否突变为其他碱基判别大麦脂肪加氧酶－１缺失大麦为特征的大麦脂肪加氧酶－１缺失大麦的筛选方法，以及使用由通过该筛选方法所得大麦得到的麦芽酒精饮料用原料的麦芽酒精饮料制造方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及，大麦脂肪加氧酶-1基因、大麦的筛选方法、麦芽酒精饮料用原料及麦芽酒精饮料的制造方法。
技术介绍
麦芽所含的酶大麦脂肪加氧酶-1(下称“LOX-1”)在制造麦芽酒精饮料时的下料步骤中，氧化来自麦芽的亚油酸生成9-氢过氧基十八碳二烯酸(Kobayashi，N.et al.，J.Ferment.Bioeng.，76，371-375，1993)。接着，9-氢过氧基十八碳二烯酸通过类似过加氧酶(peroxygenase)的活性被变换成三羟十八碳烯酸(THOD)(Kuroda，H.，et al.，J.Biosci.Bioeng.，93，73-77，2002)。已知THOD使啤酒泡沫稳定性下降，还产生涩味，使口感变差(Kobayashi，N.，J.Am.Soc.Brew.Chem.6037-41.2002；Kaneda，H.et al.，J.Biosci.Bioeng.，92，221-226.2001)，引起麦芽酒精饮料的品质下降。此外，已知9-氢过氧基十八碳二烯酸还变换成被认为是长时间放置引起麦芽酒精饮料产生纸板气味(カ一ドボ一ド臭)的物质反式-2-壬烯醛(安井，酿造协会志，9694-99(2001))。为了改善麦芽酒精饮料的香味持久性，作为抑制反式-2-壬烯醛生成的技术，提出了制造使用LOX-1活性低的麦芽的麦芽酒精饮料的方法(Drost，J.Am.Soc.Brew.Chem.48124-131(1990))。此外，Douma等通过对大麦进行诱变剂(药剂)处理诱发突变，制作出LOX-1活性降至对照组的9％的诱发突变系，用其尝试麦芽酒精饮料的制造(国际公开第02/053721号公报)。但是，即使使用那样的大麦，得到的麦芽酒精饮料的反式-2-壬烯醛浓度的减低仍然不够，香味持久性没有得到充分改善。此外，对于THOD含量的减低和泡沫稳定性的改善并不明显。
技术实现思路
本专利技术是鉴于上述已有技术存在的问题所作的，其目的是提供，不通过基因操作而能够用于制造香味持久性和泡沫稳定性得到改善的麦芽酒精饮料的LOX-1突变基因、LOX-1缺失的大麦的筛选方法、由经筛选得到的大麦而来的麦芽酒精饮料用原料和使用所述麦芽酒精饮料用原料的麦芽酒精饮料的制造方法。本专利技术人，为了达成上述目的反复认真研究，结果在发现LOX-1活性完全缺失的已有大麦品种的同时，还发现从该大麦品种得到的新的LOX-1突变基因，从而完成了本专利技术。即，本专利技术的LOX-1突变基因的特征在于，LOX-1基因的第五内含子剪切位点(5’-GT-3’)的鸟嘌呤突变成其他碱基。这里，所述碱基以腺嘌呤为佳。此外，本专利技术的LOX-1缺失大麦的筛选方法的特征在于，通过LOX-1基因的第五内含子剪切位点的鸟嘌呤是否突变成其他碱基来判别大麦LOX-1缺失大麦。这里，所述碱基以腺嘌呤为佳。进一步，本专利技术的LOX-1缺失大麦的筛选方法的特征在于，包括从被检对象大麦提取基因组DNA的基因组DNA提取步骤；从提取的基因组DNA扩增含有LOX-1基因第五内含子剪切位点的DNA片断的DNA片断扩增步骤；将所述DNA片断扩增步骤中扩增的含有LOX-1基因第五内含子剪切位点的DNA片断用限制性酶酶切，检测指定碱基数的DNA片断，通过剪切位点的鸟嘌呤是否突变成其他碱基来判别大麦LOX-1缺失大麦的DNA片断检测步骤。这里，所述DNA片断检测步骤中使用的限制性酶以识别碱基序列5’-GTAC-3’的Afa I和/或Rsa I为佳。根据上述专利技术，基于LOX-1基因第五内含子剪切位点的鸟嘌呤突变的有无，可以判断是否是具有LOX-1活性缺失性状的大麦品种。其结果，可以不直接测定LOX-1的活性，而通过基因水平的分析，简单地筛选LOX-1活性缺失的大麦品种。尤其，有时酶活性受植物个体的繁殖阶段、环境等影响难以准确测定，根据这种方法，与酶测定不同，可以不受环境等的影响，筛选LOX-1活性缺失的大麦品种。而且，测定酶活性只有到种子成熟后才能进行，而DNA筛选在繁殖初期就可以进行，所以可以较早地判断是否具有活性缺失性状，而且对连续回交等是有效的。此外，本专利技术的麦芽酒精饮料用原料的特征在于，它是由具有本专利技术的LOX-1突变基因的大麦得到的种子、麦芽、麦芽提取物、大麦分解产物或大麦加工产物。此外，本专利技术的麦芽酒精饮料用原料的特征在于，它是由通过本专利技术的LOX-1缺失大麦的筛选方法筛选出的大麦得到的种子、麦芽、麦芽提取物、大麦分解产物或大麦加工产物。进一步，本专利技术的麦芽酒精饮料的制造方法的特征在于，使用本专利技术的麦芽酒精饮料用原料。根据上述本专利技术，原料中不含LOX-1，所以麦芽酒精饮料的制造工艺中9-氢过氧基十八碳二烯酸变得不易从亚油酸生成，因此THOD和反式-2-壬烯醛也变得难以生成，从而可以得到香味持久性和泡沫稳定性提高了的麦芽酒精饮料。本专利技术还提供序列编号10的第1～1554位碱基所表示的碱基序列构成的核酸。所述碱基序列表示编码LOX-1蛋白的脂肪加氧酶活性缺失的突变LOX-1蛋白的基因编码区域。通过大麦样本中该核酸的有无，可以判断该大麦是否具有LOX-1活性缺失的性状。本专利技术还提供序列编号11所表示的碱基序列构成的核酸。所述碱基序列表示编码LOX-1蛋白的脂肪加氧酶活性缺失的突变LOX-1蛋白的基因的基因组序列。通过检测大麦样本中该核酸的有无，可以判断该大麦是否具有LOX-1活性缺失的性状。本专利技术还提供序列编号11所表示的碱基序列构成的核酸中，含有第3178位碱基的10～60位的连续的碱基序列构成的核酸。第3178位碱基是单碱基多态，正常的LOX-1中为G，突变的LOX-1中为A。通过检测大麦样本中含有多态位点的核酸的存在与否，可以判断该大麦是否具有LOX-1活性缺失的性状。本专利技术还提供包括从大麦样本中分离基因组DNA的步骤和检测序列编号11所表示的碱基序列的第3178位碱基，将该碱基的存在作为该大麦LOX-1活性存在的指标的步骤的检测大麦中LOX-1活性存在与否的方法。根据所述方法，可以判断作为检测对象的大麦是否具有LOX-1活性缺失的性状。如果以来自这样筛选出的LOX-1活性缺失的大麦的种子、麦芽、麦芽提取物、大麦分解产物或大麦加工产物等作为原料制造麦芽酒精饮料，则可以得到香味持久性和泡沫稳定性提高了的麦芽酒精饮料。附图说明图1是探索试验1中LOX-1活性测定结果的示意图。图2是证明试验1中LOX-1抑制活性测定结果的示意图。图3是表示证明试验2中大麦种子的LOX蛋白质Western分析的结果的电泳照片。A表示SDS-PAGE后的Western分析的结果，B表示IEF后的Western分析的结果。图4是表示证明试验3中大麦种子的RNA的RT-PCR分析结果的电泳照片。图5是证明试验4中LOX-1基因第5内含子剪切位点的结构的示意图。图6是表示证明试验5中对于LOX-1突变基因剪切的分析的结果的电泳照片。A是包含第3内含子～第5内含子的扩增片断的电泳照片，B是将与A相同的扩增片断用Stu I消化后的电泳照片。图7是证明试验7、8中大肠杆菌中诱导表达蛋白质的电泳照片。图8是证明试验7、8中大肠杆菌中被诱导表达的LOX-1活性的示意图。图9是表示证明试验9中Kendall×SBOU2杂交的第2代中的D本文档来自技高网...

【技术保护点】
大麦脂肪加氧酶－１突变基因，其特征在于，大麦脂肪加氧酶－１基因的第五内含子剪切位点（５’－ＧＴ－３’）的鸟嘌呤突变成其他碱基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：广田直彦，金子隆史，黑田久夫，金田弘举，蛸井洁，武田和义，
申请(专利权)人：札幌啤酒株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]