一种鸡全血简便快速DNA提取方法技术

本发明专利技术公开一种鸡全血简便快速DNA提取方法，其提取方法包括将鸡全血加入抗凝剂后，再加入裂解液中混合，于56～60℃水溶锅放置20～30min，加入分离液，于70～80℃水溶锅放置20～30min后离心，取上清液转移到另一EP管中，再加入析出液，离心，留沉淀，加入洗涤液后混匀，离心；小心弃上清，收集沉淀室温干燥，加入TB缓冲液，即得鸡DNA提取液。本发明专利技术提取的DNA纯度和DNA完整性都能达到试验要求，浓度和纯度优于现有试剂盒提取的DNA。结合在鸡分子育种方面的应用，可证明该方法是一种成本低，操作简单，环境友好型的DNA提取方法。

A simple and rapid DNA extraction method for whole blood of chicken

【技术实现步骤摘要】
一种鸡全血简便快速DNA提取方法
本专利技术设计生物检测
，具体涉及一种鸡全血简便快速DNA提取方法。
技术介绍
20世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来，分子生物学获得空前的发展，动物分子育种在生产中的应用越来越多。基因组DNA的提取在动物分子育种中是一项基础、重要的技术，直接关系到基因检测的效果。目前，有关家禽基因组DNA的提取方法较多，如试剂盒法、盐析法、蛋白酶消化法、有机溶剂提取法等都有研究，但各种方法都存在一定的优、缺点。酚-氯仿法是提取DNA最为经典的方法，其原理是利用有机溶剂苯酚的蛋白变性，抑制DNase作用，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，合并含DNA的水相，再利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。该法在鸡DNA提取上也有应用，研究者利用该法提取迪卡系白壳蛋鸡及褐壳蛋鸡祖代鸡外周抗凝血DNA,已公开的专利：一种提取家禽基因组DNA的方法（CN101768588A）和一种提取禽类全血DNA的方法（CN101748119A），在提取过程使用到有机溶剂Tris饱和酚/氯仿。有机溶剂提取方法的优点是提取的DNA保持天然状态。该方法提取DNA的缺点是耗时比较长，约在21h；提取过程多次使用对人体有害的氯仿，苯酚等有机试剂，影响研究操作人的工作情绪；操作过程多次加入有机溶剂，步骤繁琐，提取的DNA中可能含有有机试剂，影响进一步的试验研究工作。盐析法提取DNA的原理是利用蛋白质和核酸在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。研究者用不同禽类品种(金定鸭、长乐灰鹅、象洞鸡和闽南火鸡)为试验材料，采用4种不同方法从其全血中提取DNA，比较不同方法的DNA提取效率。结果表明：由于品种之间DNA存在差异，DNA的质量和产率也有显著差异，金定鸭全血DNA用树脂法效果最佳；长乐灰鹅和闽南火鸡全血DNA用酚-氯仿法效果最佳；而盐析法是提取象洞鸡全血DNA的最佳方法。盐析法提取DNA优点，减少了有机溶剂的使用，减少了对环境和试验人员的伤害，缺点是提取DNA纯度差。吸附法提取DNA是利用核酸的吸附特性来获取组织DNA的方法。该方法的步骤是首先进行细胞的裂解和核酸，蛋白分离（如去污剂SDS,TLS,蛋白酶等），混合液经过吸附材料（树脂，玻璃等材料），核酸被吸附收集，经过特定洗脱液，收集核酸保存。该方法有开发成试剂盒产品，专供提取DNA。如TIANGEN生产的血液基因组DNA提取试剂盒，采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取血液中的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。1h内即可获得超纯的基因组DNA。该方法的优点，提取的速度快。缺点是成本高，每个样本提取材料成本约3.5元，常在小批量的科研试验研究中使用，大量的检测，如鸡的分子育种过程中，需要成千上万份的检测，成本较大。加热煮沸法是利用DNA与蛋白的不同物理化学性质提取DNA，用加热法把细胞裂解，让基因组释放出来，冰浴后通过离心把细胞壁和一些蛋白离到管底,基因组会悬浮在上清中。研究者通过煮沸提取固始鸡和安卡鸡F2代抗凝血基因组DNA，经核酸蛋白定量仪检测，DNA的OD260/OD280达1.77±0.06，证明所提DNA质量较好，用于PCR扩增，也可以得到满意的扩增效果。但这种方法提取DNA，上清中还是存在一些蛋白的;煮沸的过程对DNA的完整性造成一定的损伤,在某些时候是会影响到PCR结果。该法对样本有选择性，鸡肉及凝集血等样本没见报道使用情况。综上所述，急需一种实验操作简单，可重复性好、所用试剂安全、无毒，提取的速度快，提取纯度高，样本DNA提取成本低的综合有效的鸡血基因组DNA提取的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术存在的问题，提供一种鸡全血简便快速DNA提取方法。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为：一种鸡全血简便快速DNA提取方法，包括样本准备，样本裂解，样本分离DNA沉淀，DNA洗涤和制备DNA，具体制备步骤如下：（1）样本准备：取鸡全血，加入抗凝剂，获得鸡抗凝血；（2）样本裂解：将鸡抗凝血加入裂解液中混合，于56～60℃水溶锅放置20～30min，所述的鸡抗凝血与裂解液质量比为1：2.5，得鸡裂解血；（3）样本分离DNA沉淀：将鸡裂解血加入分离液，于70～80℃水溶锅放置20～30min后，在4000rpm离心机中离心分离10～15min，取上清液转移到另一EP管中，得鸡分离血；（4）DNA洗涤：在鸡分离血中加入析出液，于4000rpm离心机中离心分离1～2min，留沉淀，加入洗涤液后混匀，得鸡初级DNA提取液；（5）制备DNA：将鸡初级DNA提取液于4000rpm离心机中离心分离1～2min；小心弃上清，收集沉淀室温干燥，加入TB缓冲液，即得鸡DNA提取液。优选的，所述的抗凝剂为枸橼酸钠、Na2EDTA·2H2O或肝素钠。优选的，所述的枸橼酸钠终浓度为0.38%，所述的Na2EDTA·2H2O浓度为1.5～2.2mg/mL，所述的肝素钠浓度为300~400单位/ml，采集血液，加入抗凝剂后，轻微晃动离心管，抗凝剂均匀接触血液；2～8℃备用或-20℃长期保存。优选的，所述的裂解液为50mMNa2EDTA·2H2O、2%SDS、0.19MNaCl和蛋白酶K终浓度0.4μg/μL。优选的，其特征在于，所述的分离液为6MNaCl。优选的，所述的析出液为90~95%乙醇。优选的，所述的洗涤液为70%乙醇和0.14MNaCl。优选的，所述的TB缓冲液由Tris、Na2EDTA·2H2O和硼酸组成，所述的Tris浓度为0.108g/ml，Na2EDTA·2H2O浓度为7.44×10-3g/ml，硼酸浓度为5.5×10-2g/ml。优选的，所述的鸡DNA提取液在2～8℃备用或-20℃以下保存。优选的，具体制备步骤如下：（1）样本准备：取鸡全血，加入抗凝剂，获得鸡抗凝血；（2）样本裂解：将100μL鸡抗凝血加入250μL裂解液中混匀，于56～60℃水溶锅放置20～30min，得鸡裂解血；（3）样本分离DNA沉淀：将鸡裂解血加入600μL分离液，颠倒3～5次混匀，于70～80℃水溶锅放置20～30min后，在4000rpm离心机中离心分离10～15min，取200μL上清液转移到另一EP管中，得鸡分离血；（4）DNA洗涤：在鸡分离血中加入400μL析出液，于4000rpm离心机中离心分离1～2min，留沉淀，加入600μL洗涤液后上下颠倒3~5次混匀，得鸡初级DNA提取液；（5）制备DNA：将鸡初级DNA提取液于4000rpm离心机中离心分离1～2min；弃上清，收集沉淀室温干燥，加入200μLTB缓冲液，即得鸡DNA提取液。优选的，所述的室温干燥时间为5~10min。分子生物学研究首要考虑的问题是核酸的提取，是非常关键的过程。提取纯化核酸可分为三步：第一步，细胞破碎、第二步，除去样本中的蛋白，与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质、除去其他杂质核酸，第三步，核酸的纯化。提取DNA的纯度和产量直接影响后续的试验和研究。如PCR扩增、酶切反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡全血简便快速DNA提取方法，包括样本准备，样本裂解，样本分离DNA沉淀，DNA洗涤和制备DNA，其特征在于，具体制备步骤如下：（1）样本准备：取鸡全血，加入抗凝剂，获得鸡抗凝血；（2）样本裂解：将鸡抗凝血加入裂解液中混合，于56～60℃水溶锅放置20～30min，所述的鸡抗凝血与裂解液质量比为1：2.5，得鸡裂解血；（3）样本分离DNA沉淀：将鸡裂解血加入分离液，于70～80℃水溶锅放置20～30min后，在4000 rpm离心机中离心分离10～15 min，取上清液转移到另一EP管中，得鸡分离血；（4）DNA洗涤：在鸡分离血中加入析出液，于4000 rpm离心机中离心分离1～2 min，留沉淀，加入洗涤液后混匀，得鸡初级DNA提取液；（5）制备DNA：将鸡初级DNA提取液于4000 rpm离心机中离心分离1～2 min；弃上清，收集沉淀室温干燥，加入TB缓冲液，即得鸡DNA提取液。

【技术特征摘要】
1.一种鸡全血简便快速DNA提取方法，包括样本准备，样本裂解，样本分离DNA沉淀，DNA洗涤和制备DNA，其特征在于，具体制备步骤如下：（1）样本准备：取鸡全血，加入抗凝剂，获得鸡抗凝血；（2）样本裂解：将鸡抗凝血加入裂解液中混合，于56～60℃水溶锅放置20～30min，所述的鸡抗凝血与裂解液质量比为1：2.5，得鸡裂解血；（3）样本分离DNA沉淀：将鸡裂解血加入分离液，于70～80℃水溶锅放置20～30min后，在4000rpm离心机中离心分离10～15min，取上清液转移到另一EP管中，得鸡分离血；（4）DNA洗涤：在鸡分离血中加入析出液，于4000rpm离心机中离心分离1～2min，留沉淀，加入洗涤液后混匀，得鸡初级DNA提取液；（5）制备DNA：将鸡初级DNA提取液于4000rpm离心机中离心分离1～2min；弃上清，收集沉淀室温干燥，加入TB缓冲液，即得鸡DNA提取液。2.根据权利要求1所述鸡全血简便快速DNA提取方法，其特征在于，所述的抗凝剂为枸橼酸钠、Na2EDTA·2H2O或肝素钠；所述的枸橼酸钠终浓度为0.38%，所述的Na2EDTA·2H2O浓度为1.5～2.2mg/mL，所述的肝素钠浓度为300~400单位/ml。3.根据权利要求1所述鸡全血简便快速DNA提取方法，其特征在于，所述的裂解液为50mMNa2EDTA·2H2O、2%SDS、0.19MNaCl和蛋白酶K终浓度0.4μg/μL。4.根据权利要求1所述鸡全血简便快速DNA提取方法，其特征在于，所述的分离液为6MNaCl。5.根据权利要求1所述鸡全血简便快速DNA提取方法，其特征在于，所述的析出液为90...

【专利技术属性】
技术研发人员：王树艳，沈前程，李军成，凌丁，
申请(专利权)人：广西农业职业技术学院，
类型：发明
国别省市：广西,45