本发明专利技术涉及一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，同时本发明专利技术还涉及腺苷脱氨酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷、２－酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况（速度），从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。采用本发明专利技术完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，同时本专利技术还涉及用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，属于医学检验测定
技术介绍
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是腺苷(白色结晶粉末)+水(H2O)腺苷脱氨酶肌苷(Inosine)+氨离子(NH4+)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。检索发现，申请号为03128092.7、申请日为2003.05.29、名称为《一种测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法》的中国专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰氨辅酶配制的测定试剂。该专利技术所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰氨辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰氨辅酶或其类似物，及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰氨辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰氨辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该专利技术所指的酶法试剂就可达到测定样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的目的。该专利技术的特点在于为腺苷脱氨酶的测试提供一个内源合成腺苷脱氨酶反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的腺苷脱氨酶试剂。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分腺苷脱氨酶试剂(腺苷脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶反应必定将还原型烟酰氨辅酶氧化成氧化型烟酰氨辅酶)的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的腺苷脱氨酶活性的测定方法，同时给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术测定腺苷脱氨酶活性的方法步骤如下1)、将样品与主要由腺苷、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，得出腺苷脱氨酶测定结果。以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。这种方法应用腺苷脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶反应连续监测法。腺苷脱氨酶酶解腺苷产生氨，再通过偶联谷氨酸脱氢酶的作用，产生谷氨酸，通过谷氨酸激酶催化和ATP生成ADP，ADP再和磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下最后产生丙酮酸，再通过偶联乳酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性大小。本专利技术的优点是反应利用了二个分子的还原型辅酶，也产生了二个分子的氧化型辅酶，因此吸光度有二倍的变化速度，灵敏度也就提高了二倍。实现本专利技术方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液40--200mmol/l 腺苷 0.5--50mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l还原型辅酶0.15--0.3mmo/l腺苷三磷酸1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l谷氨酸脱氢酶 1000--50000U/l谷氨酸激酶1000--50000U/l丙酮酸激酶500--20000U/l乳酸脱氢酶1000--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源氨、谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸污染试剂I缓冲液40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l还原型辅酶0.15--0.3mmo/l腺苷三磷酸1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l谷氨酸脱氢酶 1000--50000U/l谷氨酸激酶1000--50000U/l丙酮酸激酶500--20000U/l乳酸脱氢酶1000--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)试剂II缓冲液40--200mmol/l 腺苷0.5--50mmol/l稳定剂 10--50mmol/l双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶等可以放在试剂II。试剂II其中的成分，腺苷也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源氨、谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸污染，还更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液 40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l还原型辅酶 0.15--0.3mmo/l腺苷三磷酸 1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l稳定剂 10--50mmol/l试剂II缓冲液 40--200mmol/l谷氨酸脱氢酶 1000--50000U/l谷氨酸激酶 1000--50000U/l丙酮酸激酶 500--20000U/l乳酸脱氢酶 1000--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)试剂III缓冲液 40--200mmol/l 腺苷0.5--50mmol/l稳定剂 10--50mmol/l三剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸等可以放在试剂II或试剂III中。试剂II其中的成分，谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶等也可以放在试剂I或试剂III中，试剂III其中的成分，腺苷也可以放在试剂I或试剂II中，如此可以形成多种配方，不一一详述。缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，步骤如下：１）、将样品与主要由腺苷、２－酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应：腺苷＋水 腺苷脱氨酶肌苷＋氨离子氨离子＋２－酮戊二酸酯＋还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸＋辅酶＋水腺苷三磷酸＋谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸＋谷氨酸５－磷酸腺苷二磷酸＋磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸＋ 丙酮酸丙酮酸＋还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸＋辅酶２）、检测最终反应物在主波长３４０ｎｍ吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：王尔中，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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