本发明专利技术公开了菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv‑sNPF和其受体以及在提高小菜蛾体内海藻糖含量中的应用。本发明专利技术首次在菜蛾盘绒茧蜂‑小菜蛾寄生系统中发现菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv‑sNPF和其寄主小菜蛾体内的受体Px‑sNPFR；该菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv‑sNPF不仅能够与小菜蛾体内的受体Px‑sNPFR结合，还能够提高小菜蛾体内的海藻糖含量。
Cotesiaplutellae sNPF neuropeptide Cv and its receptors in vivo and improve the application of trehalose content in diamondback moth
The present invention discloses cotesiaplutellae Cv neuropeptide sNPF and its receptor in vivo and improve the application of trehalose content in diamondback moth. The first discovery of cotesiaplutellae Cv neuropeptide sNPF and its receptor Px host Plutella xylostella larvae in sNPFR cotesiaplutellae diamondback moth parasitic system; the cotesiaplutellae neuropeptide Cv sNPF can not only and plutellaxylostella receptor Px sNPFR binding, also to improve the trehalose content of Plutella xylostella larvae.
【技术实现步骤摘要】
菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF和其受体以及在提高小菜蛾体内海藻糖含量中的应用
本专利技术涉及分子生物学和基因工程
，尤其涉及菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF和其受体以及在提高小菜蛾体内海藻糖含量中的应用。
技术介绍
神经肽是一类重要的传递信息的小分子物质，影响着生物体内几乎所有生理进程，在中枢神经系统中作为神经调质而存在，在血液中则扮演着神经激素的角色。shortneuropeptideF(sNPF)是无脊椎动物中一种重要的肽类物质，参与调控取食、生长发育、运动、时钟节律、学习和记忆等多种生理过程。它是脊椎动物neuropeptideY(NPY)的直系同源蛋白，序列存在相似性，且都是通过结合G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptor，GPCR)，激活下游效应器发挥调控作用。sNPF在昆虫和甲壳类中分布广泛，成熟肽C末端有保守的xPxLRLRFamide(x指任意氨基酸)受体激活序列。sNPF的基因拷贝发生在基因内，即一条前体序列上含有1到多个拷贝，而不同的物种中拷贝数不相同。昆虫中，越是高等的全变态昆虫(鞘翅目、双翅目、鳞翅目)的肽前体序列趋向于更长，拷贝数越多。目前，对sNPF的研究主要围绕着以黑腹果蝇Drosophilamelanogaster为主的模式昆虫开展，对于非模式昆虫缺乏系统的研究。目前，对sNPF功能的解析尚不全面，已有研究均主要以调控取食、生长和发育为主；同时，sNPF的功能在不同物种间、同一物种不同发育阶段并不完全一致。而寄生蜂是农业上重要的天敌昆虫，其部分生活史依赖于寄主。寄生蜂利用多种手段控制其寄主，为其自身或后代的发育创造优越的生长环境。寄生蜂发育过程中与寄主之间存在着互作关系，一旦脱离便可能造成发育不良甚至死亡。在长期进化过程中，寄生蜂掌握了对付和利用寄主的策略，可以抑制寄主的免疫系统，改变寄主的激素水平以及其他生理进程。以内寄生蜂为例，寄生蜂在产卵的同时向寄主体内注入毒液、病毒粒子等寄生因子，破坏寄主的免疫系统，以及调控寄主的一些生理行为。此外，蜂卵孵化过程中浆膜层释放形成的畸形细胞以及发育长大的幼蜂也都会分泌一些物质到寄主体内发挥调控作用。目前，对于寄生体系中生理调控的研究主要集中在免疫、生长发育和营养代谢方面，其他如神经内分泌方面的研究只有零星报道，如寄主的一些神经肽基因，抑咽侧体激素(allatostatin)、促咽侧体激素(allatotropin)、促前胸腺激素(prothoraciotropichormone，PTTH)等的表达在寄生蜂寄生前后会发生显著变化，但都不涉及调控机制。因此，有必要对非模式昆虫的sNPF功能做进一步探究，尤其是寄生蜂的神经内分泌方面的研究。
技术实现思路
本专利技术提供了菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF和其受体以及在提高小菜蛾体内海藻糖含量中的应用，该菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF能够与小菜蛾体内的受体Px-sNPFR结合，并提高小菜蛾体内的海藻糖含量。具体内容如下：本专利技术提供了一种菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF，其氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。该神经肽为成熟肽，是前体序列经蛋白酶切割形成的肽段。本专利技术发现所述的菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF能够提高小菜蛾体内海藻糖含量中的应用。具体地，所述的应用，包括：将菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF注入小菜蛾体内。具体地，所述海藻糖位于小菜蛾的血浆中。本专利技术还提供了菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF的前体序列，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，该前体序列由Cv-sNPF基因开放阅读框(ORF)编码得到，该Cv-sNPF基因开放阅读框(ORF)的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的前体序列也可用于提高小菜蛾体内的海藻糖含量；即：将所述前体序列注入小菜蛾体内。本专利技术还提供了一种如权利要求1所述菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF的受体，所述受体为Px-sNPFR，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，编码所述受体的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供了Px-sNPFR作为菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF受体中的应用；所述Px-sNPFR的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了所述受体在提高小菜蛾体内海藻糖含量中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次在菜蛾盘绒茧蜂-小菜蛾寄生系统中发现菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF和其寄主小菜蛾体内的受体Px-sNPFR；该菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF不仅能够与小菜蛾体内的受体Px-sNPFR结合，还能够提高小菜蛾体内的海藻糖含量。附图说明图1为实施例1中Cv-sNPF基因的前体序列；其中，下划线表示信号肽；加粗表示预测的成熟肽序列；浅灰表示断裂位点；深灰表示酰胺化信号。图2为实施例1中Px-sNPFR基因的ORF序列；其中，该Px-sNPFR基因的ORF序列有7个典型的跨膜结构域，属于GPCR家族；下划线标出7个跨膜结构域。图3为实施例3中不同梯度浓度的Cv-sNPF刺激对转染有pcDNA3.1(+)/Px-sNPFR质粒的HEK293细胞内的cAMP浓度的影响；其中，LogLigand表示Cv-sNPF的浓度；cAMPLevel表示cAMP的浓度。图4为实施例3中不同梯度浓度的Cv-sNPF刺激对转染有pcDNA3.1(+)/Px-sNPFR质粒的HEK293细胞内的Ca2+浓度的影响。图5为实施例4中注射Cv-sNPF后小菜蛾血淋巴中海藻糖含量的变化情况；其中，Trehaloseinhemolymph表示血淋巴中海藻糖的含量；所有的数据是平均值±标准误差；利用SPSS19进行显著性分析，组间进行单因素方差分析(Tukey’s检验)，显著水平为*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。具体实施方式实施例11、菜蛾盘绒茧蜂Cv-sNPF基因和小菜蛾Px-sNPFR基因的ORF序列的获取(1)收集菜蛾盘绒茧蜂幼蜂和小菜蛾幼虫：取寄生后5-6天左右的小菜蛾，在显微镜下，昆虫培养基中解剖。先撕开一个口便于幼蜂滑出，加入新培养基，清洗几次后，弃洗液，加入预冷的1mlTRIzol，研磨后置于-80℃备用；取生长至4龄中的小菜蛾幼虫3只，酒精清洗后放置于1mlTRIzol，研磨后置于-80℃备用。(2)采用TRIzol法提取菜蛾盘绒茧蜂和小菜蛾的总RNA，再利用试剂盒SuperScriptTMIIReverseTranscritase(Invitrogen)合成cDNA第一链。(3)根据菜蛾盘绒茧蜂转录组(SAMN03406711)数据和小菜蛾基因组数据库DBM(http://iae.fafu.edu.cn/DBM/)，通过生物信息学方法筛选得到疑似Cv-sNPF和Px-sNPFR基因的序列。2、菜蛾盘绒茧蜂Cv-sNPF基因和小菜蛾Px-sNPFR基因的克隆和序列分析根据上述获得的疑似Cv-sNPF和Px-sNPFR基因的序列，设计扩增ORF的引物进行PCR验证。引物信息见表1。表1PCR扩增Cv-sNPF和Px-sNPFR的引物PCR产物经过pGEM-Teasy(Promega)试剂盒连接后，利用热激法将连接产物转化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv‑sNPF，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
【技术特征摘要】
1.一种菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。2.如权利要求1所述的菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF在提高小菜蛾体内海藻糖含量中的应用。3.一种菜蛾盘绒茧蜂神经肽Cv-sNPF的前体序列，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈学新，邹佳妮，王泽华，时敏，黄健华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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