酶法测定镁离子含量的方法及镁离子诊断试剂盒技术

本发明专利技术涉及酶法测定镁离子含量的方法以及镁离子诊断试剂盒。应用血浆、血清等样品中镁离子激活甘油激酶活性的特点，在腺苷三磷酸的存在下与甘油反应生成甘油－３－磷酸，再偶联甘油－３－磷酸氧化酶、过氧化氢酶、醛脱氢酶，将氧化型辅酶反应成还原型辅酶，通过测定主波长３４０ｎｍ处吸光度的上升幅度而测定出样品中镁离子的含量。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外／可见光分析仪或者半自动／全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶法测定血浆、血清等样品中镁离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的镁离子诊断试剂盒，属于医学检验测定

技术介绍
目前医学上测定血浆、血清等样品中镁离子含量(简称镁测定)的手段比较多，概括起来有比色法、荧光法、离子色谱法、离子选择性电极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀释质谱法(ID-MS)等。其中决定性的方法是ID-MS，其次是AAS，这两种方法虽然结果准确，但设备复杂、费用昂贵，不适用于常规实验室和自动分析。比色法是应用最广泛的方法，包括甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达旦黄法、邻甲酚酞络合酮法(OCPC)、钙镁试剂法(Calmagite)以及新近报道的2-(8’-羟基喹啉-5’-磺酸-7’-偶氮)-变色酸法(8Q5SAC)。比色法操作简便、费用低，适合常规实验室应用，但存在试剂空白吸光度高、易受胆红素和其它阳离子干扰、试剂稳定性差，以及试剂中含有腐蚀性或毒性成分等缺点。离子选择性电极法(ISE)可以测定生理溶液中镁离子活度，采用中性载体(ETH7025)液膜离子选择电极，测定的准确度较高，但仍存在生理范围内的钙干扰，Ca2+最大干扰达10％。离子色谱法在测定之前需要对样本进行预处理，包括酸化稀释和过滤。Thienpont等使用该方法对五种“国际标准和技术学会”用火焰原子吸收分光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅为0.35％，认为离子色谱法可作为测定镁元素总量的有价值的参考方法。酶法测定血浆、血清等样品中镁离子(主要是Mg2+)的研究近几年非常活跃，取得了较大进展。目前已应用于Mg2+测定的酶学方法有①甘油激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；②甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；⑥异柠檬酸脱氢酶法；⑦丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联法。总体上看，采用酶法检测镁离子结果准确、干扰小、适合于自动化分析。但是，应用不同的检测试剂和测试路线，检测的灵敏度、检测结果的准确性会有很大差别，直接影响到该方法的使用与推广，这正是人们在该领域内不断研究、发展和创新的原因所在。由于有着非常好的应用前景，对酶法检测镁离子的研究已经成为该领域内的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酶法测定镁离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的镁离子诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪对血浆、血清等样品中镁离子的含量进行快速、准确测定，以便推广使用酶法检测镁离子的方法以及相应的诊断试剂盒，使该领域内检测手段得到进一步丰富和发展。为实现本专利技术的目的，一种酶法测定镁离子含量的方法，采用以下步骤进行首先，将血浆、血清等需要测定的样品与含有甘油、腺苷三磷酸、甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶、乙醇、过氧化氢酶、醛脱氢酶和氧化型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应， 然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的上升幅度，进而测算出样品中镁离子的含量。测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。实现本专利技术方法的镁离子诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液 40～200mmol/l，甘油1～40mmol/l，腺苷三磷酸 0.2～20mmol/l，乙醇1～30mmol/l，氧化型辅酶 0.5～20mmol/l，甘油激酶1000～50000U/l，甘油-3-磷酸氧化酶 1000～50000U/l，过氧化氢酶 500～50000U/l，醛脱氢酶500～50000U/l，稳定剂/试剂总体积 10～80％。也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，以利于消除内、外源物质的污染，比如 双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分甘油、腺苷三磷酸、乙醇、氧化型辅酶、甘油-3-磷酸氧化酶、过氧化氢酶、醛脱氢酶等，可以放在试剂II；试剂II中的甘油激酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源物质的污染，还有利于试剂更稳定 与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的甘油、腺苷三磷酸、乙醇、氧化型辅酶等，可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的甘油-3-磷酸氧化酶、过氧化氢酶、醛脱氢酶等，可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的甘油激酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。上述诊断试剂盒的成分当中，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸(Phosphate)缓冲液”或者“磷酸盐(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)缓冲液”中的至少一种，但选择范围并不受这些列举所限制。此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。用作稳定剂的物质可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。上述镁离子诊断试剂盒的试剂成分当中，所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NAD+)或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADP+)；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NADH)或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADPH)。研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的镁离子诊断试剂盒较为理想，也是本专利技术的优选方案缓冲液 80～120mmol/l，甘油10～20mmol/l，腺苷三磷酸 2～8mmol/l，乙醇3～12mmol/l，氧化型辅酶 1～5mmol/l，甘油激酶10000～30000U/l，甘油-3-磷酸氧化酶 10000～30000U/l，过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法测定镁离子含量的方法，包括以下步骤：①将待测样品与含有甘油、腺苷三磷酸、甘油激酶、甘油－３－磷酸氧化酶、乙醇、过氧化氢酶、醛脱氢酶和氧化型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，甘油＋腺苷三磷酸＊甘油－３－磷酸＋腺苷二磷酸 甘油－３－磷酸＋氧＊磷酸二羟丙酮＋过氧化氢过氧化氢＋乙醇＊乙醛＋水乙醛＋氧化型辅酶＋水＊乙酸＋还原型辅酶＋氢离子②将反应混合物置于紫外／可见光分析仪或者半自动／全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ的吸光度 的上升幅度，测算出样品中镁离子的含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]