血氨含量测定方法及血氨诊断试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种测定血氨含量的方法，同时本发明专利技术还涉及血氨诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、谷氨酸、腺苷三磷酸、丙酮酸、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况（速度），从而测算出血氨的含量。采用本发明专利技术完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种测定血氨含量的方法，同时本专利技术还涉及血氨诊断试剂盒，属于医学检验测定

技术介绍
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％--13％；离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％--4.8％，回收率高，但均需专门的仪器，不适合我国的具体实际。检索中国专利，仅查出87105593.7号专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的血氨含量的测定方法，同时给出用以实现本专利技术方法的血氨诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行血氨含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术测定血氨含量的方法步骤如下1)、将样品与主要由谷氨酸、腺苷三磷酸、丙酮酸、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢丙酮酸+二氧化碳+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)苹果酸+氧化型辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的幅度，测算出血氨的含量。通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，测算出血氨的含量。以上样品与试剂的混合比例为按体积1/10到1/100，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。本专利技术应用谷氨酰胺合成酶偶联偶联丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶(脱羧化)(EC 1.1.1.38或EC 1.1.1.39或EC 1.1.1.40或EC1.1.1.83之一)反应比色法。谷氨酰胺合成酶利用氨、谷氨酸、腺苷三磷酸产生磷酸根，磷酸根再和丙酮酸在丙酮酸氧化酶作用下生成二氧化碳，二氧化碳(碳酸氢根)再和丙酮酸经苹果酸脱氢酶脱羧作用后产生苹果酸，并将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的幅度，通过测量340nm处吸光度下降的幅度，可以测算二氧化碳(碳酸氢根)的含量。用于实现本专利技术方法的血氨诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液40--200mmol/l谷氨酸1--20mmol/l腺苷三磷酸1--20mmol/l丙酮酸1--20mmol/l还原型辅酶0.2--0.3mmol/l谷氨酰胺合成酶500--60000U/l丙酮酸氧化酶 500--60000U/l苹果酸脱氢酶 500--80000U/l稳定剂10--80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源磷酸根、二氧化碳污染试剂I缓冲液40--200mmol/l谷氨酸1--20mmol/l腺苷三磷酸1--20mmol/l丙酮酸1--20mmol/l还原型辅酶0.2--0.3mmol/l丙酮酸氧化酶 500--60000U/l苹果酸脱氢酶 500--80000U/l稳定剂10--80％(总体积)试剂II缓冲液40--200mmol/l 谷氨酰胺合成酶500--60000U/l稳定剂10--80％(总体积)双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，谷氨酸、腺苷三磷酸、丙酮酸、还原型辅酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶等可以放在试剂II，试剂II其中的成分，谷氨酰胺合成酶也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源磷酸根、二氧化碳污染，还更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液40--200mmol/l谷氨酸1--20mmol/l腺苷三磷酸1--20mmol/l丙酮酸1--20mmol/l还原型辅酶0.2--0.3mmol/l稳定剂10--50mmol/l试剂II缓冲液40--200mmol/l丙酮酸氧化酶 500--60000U/l苹果酸脱氢酶 500--80000U/l稳定剂10--80％(总体积)试剂III缓冲液40--200mmol/l谷氨酰胺合成酶500--60000U/l稳定剂10--80％(总体积)三剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，谷氨酸、腺苷三磷酸、丙酮酸、还原型辅酶等可以放在试剂II或试剂III中。试剂II其中的成分，丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶等也可以放在试剂I或试剂III中，试剂III其中的成分，谷氨酰胺合成酶也可以放在试剂I或试剂II中，如此可以形成多种配方，不一一详述。缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液(例如还可以是咪唑/盐酸缓冲液6.2-7.8；磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液5.0-8.0；柠檬酸 柠檬酸钠缓冲液5.0-6.6；磷酸盐缓冲液6.0-8.0；磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液6.0-8.0；磷酸二氢钾 氢氧化钠缓冲液6.0-8.0；巴比妥钠-盐酸缓冲液6.8-9.6；Tris 盐酸缓冲液7.0-9.0；硼酸 硼砂缓冲液7.4-9.0；甘氨酸-氢氧化钠缓冲液8.6-10.6；砂-氢氧化钠缓冲液9.2-10.0；碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液8.8-10.6(Ca2+、Mg2+存在时不得使用)；PBS缓冲液7.0-7.6等)。以上还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等还原型烟酰胺辅酶或其衍生物。此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上，还可以在硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、丁二酸盐等中选择。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本专利技术血氨诊断试剂盒较为理想缓冲液80--120mmol/l谷氨酸6--10mmol/l腺苷三磷酸2--12mmol/l丙酮酸5--15mmol/l还原型辅酶0.2--0.3mmol/l谷氨酰胺合成酶6000--12000U/l丙酮酸氧化酶 6000--12000U/l苹果酸脱氢酶 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定血氨含量的方法，步骤如下：１）、将样品与主要由谷氨酸、腺苷三磷酸、丙酮酸、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、苹果酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应：氨＋谷氨酸＋腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨 酰胺＋腺苷二磷酸＋磷酸根磷酸根＋丙酮酸＋氧＋水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸＋二氧化碳＋过氧化氢丙酮酸＋二氧化碳＋还原型辅酶苹果酸脱氢酶（脱羧化）苹果酸＋氧化型辅酶２）、检测最终反应物在主波长３４０ｎｍ吸光度下 降的幅度，测算出血氨的含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]