构建分泌细菌重组蛋白的前导肽制造技术

本发明专利技术提供分离前导肽的方法，前导肽能指导异源蛋白质从细菌细胞质中输出。此方法取决于从推定前导肽或前导肽突变体的文库筛选可迅速输出的序列，因此能保护细胞质中短寿报告蛋白不受降解。本文鉴定的突变前导肽显示提供稳态水平显著更高的输出，不仅用于短寿报告蛋白，也用于其它稳定的长效蛋白质。这些前导肽可用于指导或提高蛋白质分泌。本发明专利技术进一步揭示经Ｔａｔ途径输出细胞质折叠的蛋白质。具二硫键的蛋白质首先在适当氧化突变菌株的细胞质内折叠。这种细胞质预折叠的蛋白质含二硫键，随后经Ｔａｔ途径输出。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
本申请要求以George Georgion和Matthew DeLisa的名义于2001年11月5日提交的美国临时申请第60/337,452号和2002年8月21日提交的美国临时申请第60/---，---号的优先权，所述申请题为“构建分泌细菌重组蛋白的前导肽”。特在此全文并入这两项申请以供参考。1.专利技术背景本专利技术一般涉及遗传工程和蛋白质分泌领域。具体而言，本申请涉及分泌细菌重组蛋白的前导肽。2.相关技术的描述从细胞质分泌的蛋白质是用称为前导肽的一般长约15-30个氨基酸的N-末端肽延伸部分合成的。可在输出到胞质外部位时或这以后通过蛋白水解从成熟的蛋白质上除去这种前导肽。最近的发现显示在革兰氏阴性菌中实际上有四种蛋白质输出途径(Stauart和Neupert，2000)一般分泌(Sec)途径(Danese和Silhavy，1998；Pugsley，1993)、信号识别颗粒(SRP)依赖途径(Meyer等，1982)、YidC依赖途径(Samuelson等，2000)和双精氨酸易位(Tat)系统(Berks，1996)。在前三种这些途径中，多肽经‘螺纹’(threading)机制跨膜，即未折叠多肽插入蛋白SecY、SecE和SecG形成的孔-类似结构并经需水解ATP的过程推动跨膜(Schatz和Dobberstein，1996)。相反，经Tat途径输出的蛋白质以部分或也许甚至充分折叠的构象横跨膜。细菌Tat系统与植物叶绿体类囊体膜的‘ΔpH依赖’蛋白质输入途径紧密相关(Settles等，1997)。经Tat途径输出不需要ATP水解且不包括经SecY/E/G孔的通过。在大部分情况中，此途径的天然底物是蛋白质，它们需在细胞质中折叠以获得一定范围的辅因子如FeS中心或molybdopterin。然而，不含辅因子但折叠太迅速或过紧而不能经任何其它途径输出的蛋白质可通过融合到Tat-特异前导肽从细胞质中分泌(Berks，1996；Berks等，2000)。膜蛋白TatA、TatB和TatC是大肠杆菌中Tat易位酶的必要成分(Sargent等，1998；Weiner等，1998)。此外，TatA同源的TatE尽管不必需，也可在易位中起作用且不能排除其它因子的参与。TatA、TatB和TatE都是整合膜蛋白，预计用它们面向细胞质的C-末端结构域横跨内膜一次。预测TatA和TatB蛋白是单次横跨蛋白，而TatC蛋白有6个跨膜部分且预计作为易位通道和前蛋白受体发挥功能(Berks等，2000；Bogsch等，1998；Chanal等，1998)。突变TatB或C完全去除输出(Bogsch等，1998；Sargent等，1998；Weiner等，1998)。纯化自大肠杆菌的Tat复合体仅包含TatABC(Bolhuis等，2001)。体外重建易位复合体证明对TatABC的最小需求和完整的膜潜能(Yahr和Wichner，2001)。选择前导肽和因而在输出特定蛋白质中所用的途径可确定是否产生正确折叠的功能蛋白(Bowden和Geogiou，1990；Thomas等，2001)。Feilmeier等(2000)显示绿色荧光蛋白(GFP)融合到Sec-特异前导肽或麦芽糖结合蛋白C-末端(MBP也经Sec途径输出)导致绿色荧光蛋白和MBP-GFP输出到周质。然而，周质中的绿色荧光蛋白是非荧光的，说明分泌蛋白错折叠并因此不能形成绿色荧光蛋白的发色团。由于经Sec途径输出的蛋白质以未折叠形式横跨膜，推断细菌分泌区室(周质空间)的环境不利于绿色荧光蛋白折叠(Feilmeier等，2000)。相反，Tat-特异前导肽融合绿色荧光蛋白导致绿色荧光蛋白积聚在周质空间中。在此情况中，Tat-GFP前肽首先能在细胞质中折叠，随后作为完全折叠的蛋白输出到周质空间中(Santini等，2001；Thomas等，2001)。然而，没有证据显示除了TorA的前导肽能用于使异源蛋白质输出到大肠杆菌的周质空间。发生蛋白质折叠的细胞区室可对生物活性蛋白质产量有巨大作用。细菌细胞质包含大量蛋白质折叠辅助因子，如伴侣分子，其促进新合成多肽折叠的功能和作用受ATP水解控制。相反，细菌细胞质包含相对少的伴侣分子且没有证据显示ATP存在于此区室。因此，许多蛋白质不能在细胞质中折叠并仅可在细胞质环境中达到它们的天然状态。唯一已知能从细胞质中分泌折叠蛋白的方法是通过融合到Tat-特异前导肽。然而，经Tat输出系统的蛋白质流出显著低于更广泛使用的Sec途径。结果，经Tat途径输出的蛋白质积聚和稳态产量较低。因此现有技术缺少指导折叠蛋白从细胞质有效输出的方法。本专利技术实现本领域长期存在的需要和理想。专利技术概述本专利技术提供分离序列的方法，序列能作为前导肽指导异源蛋白质的输出。专利技术的一方面可分离能指导蛋白质到Tat分泌途径的前导肽。此外，本专利技术揭示鉴定前导肽突变体的方法，突变体能改进蛋白质输出。一方面，专利技术因此提供鉴定前导肽的方法，前导肽在细菌中指导提高的蛋白质分泌。在一个实施方案中，本文所示方法包括从突变前导肽文库中筛选可迅速输出的序列，因此能保护细胞质中短寿报告蛋白不受降解。调节经大肠杆菌双精氨酸易位(Tat)途径分泌的前导肽以及指导其它分泌途径如细菌中sec途径的前导肽能通过本文所示方法分离。也揭示了改进输出的突变前导肽序列。突变前导肽显示提供稳态水平显著更高的输出，不仅用于短寿报告蛋白，也用于其它稳定的长效蛋白质。在本专利技术的一方面，提供鉴定前导肽的方法，前导肽指导经途径的蛋白质输出增加，途经包括但不限于双精氨酸易位(Tat)途径和sec途径。这种方法可包括构建表达盒，将突变前导肽置于编码短寿报告蛋白的基因上游。产生短寿报告蛋白可通过将胞质降解序列附于编码报告蛋白的基因。随后在细菌中表达所得表达盒，测量这些细菌中报告蛋白的表达。表现出报告蛋白表达增加的细胞中表达突变前导肽包括指导细菌中蛋白质输出增加的前导肽。上面方法鉴定的代表前导肽包括SEQ ID NO120-136。在本专利技术的另一方面，提供经途径增加多肽输出的方法，途经包括但不限于Tat途径和sec途径。此方法包括表达盒，将本文所示方法鉴定的突变前导肽置于编码感兴趣异源多肽的基因上游。在本专利技术的又一方面，提供方法筛选经途径抑制或提高蛋白输出的化合物，途经包括但不限于Tat途径和sec途径。此方法可首先包括构建表达盒，将本文所示方法鉴定的突变前导肽置于编码短寿报告蛋白的基因上游。产生短寿报告蛋白可通过将胞质降解序列附于编码报告蛋白的基因。随后在细菌中表达所得表达盒，在候选化合物存在或缺乏时测量这些细菌中报告蛋白的表达。候选化合物存在时测得的报告蛋白表达增加说明候选化合物提高蛋白质输出，而候选化合物存在时测得的报告蛋白表达减少说明候选化合物抑制蛋白质输出。在本专利技术的另外一方面，提供在细菌中产生可溶和生物-活性异源多肽的方法，多肽含多个二硫键。此方法可包括构建表达盒，将指导蛋白质经双精氨酸易位途径输出的前导肽置于编码异源多肽的基因上游。异源多肽随后在有氧化细胞质的细菌中表达。本专利技术的其它和进一步方面、特征和优势从下列专利技术目前较佳实施方案的描述中显然。这些实施方案用于揭示。附图简述上述专利技术的特征、优势和目标以及其它本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定指导细菌中蛋白质输出的前导肽的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：ａ）获得编码突变前导肽的核酸序列文库；ｂ）构建表达盒集合，包括将编码突变前导肽的所述核酸序列置于编码短寿报告蛋白的核酸序列上游，其中所述短寿报告蛋白在 细菌细胞质中被降解；ｃ）在细菌中表达所述表达盒集合；ｄ）测量所述细菌中所述报告蛋白的表达；以及ｅ）收集细菌细胞，其所述报告蛋白的表达相对不表达前导肽的细菌增加，前导肽指导所述短寿报告蛋白的蛋白质输出，其中，所 述报告蛋白表达增加的细胞中表达的突变前导肽是指导从细胞质输出的前导肽，由此所述输出使所述短寿报告蛋白在细胞质中不被降解。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：G乔治欧，M德利沙，
申请(专利权)人：研究发展基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]