植物病原真菌致病性的快速鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种植物病原真菌致病性的快速鉴定方法，属微生物技术领域。以甘薯长喙壳菌在芋头片上的生长代替对原寄主（石榴苗）的接种，快速鉴定病菌菌株的致病性。本发明专利技术具有如下优点：效率高，可在短时间内对大量菌株进行致病性鉴定。操作简单，价格便宜。结果可靠，效果直观，极大地提高了工作效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，具体的说是一种快速筛选植物病害致病性的方法，属微生物

技术介绍
真菌引起的植物病害已达3万种，占植物病害的70-80％，危害严重又具有毁灭性的的作物病害如马铃薯晚疫病，麦类锈病，稻瘟病，甘薯黑斑病等。要准确诊断一种真菌是否是引起该病害的病原，必须经过致病性接种验证。然而，对于一些病害从接种到出现症状时间则较长，为了对病害快速诊断、鉴定，及时采取有效的防治措施，挽回因病害造成的经济损失，快速致病性鉴定显得尤为重要。如由真菌致病疫霉(Phytophthrora infestance)引起的马铃薯晚疫病的致病性研究中，通常在温室进行，采用整株马铃薯植株接种，同时提供病害发生适宜的温湿度环境条件。当马铃薯离体叶片接种快速鉴定致病性的方法一经问世，就被广泛采用。由细菌假单胞属丁香假单胞致病变种(Pseudomonassyringae pv.syringae)侵染引起的梨细菌性疫病，在成熟的梨上验证致病性非常困难，只有非常幼嫩的组织才感病，通常采用未成熟的梨接种鉴定其致病性。然而，嫩梨每年只有很短的时间可获得。梨树离体叶片接种方法既方便，又快速，相对嫩梨10天发病，离体叶片接种只须2-3天即可发病，并可在梨树整个生长季节进行大量菌株的致病性分析。但以上的致病性快速鉴定方法只适用于同一寄主上的单一病害。中国新记录病害——由真菌甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)引起的石榴枯萎病，一经发现，少则2周，多则一年余全株枯死，死亡率极高。该病菌寄主范围广泛，包括甘薯、芋头、橡胶、咖啡、可可等30多种重要作物和经济林木。采用传统的致病性对原寄主接种的方法，在石榴产地蒙自，用分离至石榴的甘薯长喙壳菌对幼苗(一年生)和大树接种到出现典型症状(全株枯死)5周-1年。由于从接种到症状显现时间长，只能在石榴产地，温湿度利于发病和石榴生长。要进行大量菌株致病性、毒力测定，或异地大面积温室种苗接种以监测田间病害流行变化或品种抗性鉴定几乎是不可能的。为此，我们进行了一系列试验，以期找到该病菌致病性的快速鉴定方法，获得了满意的结果。
技术实现思路
为了克服传统技术中的不足，提供一种操作简单、结果可靠、效率高的植物病害致病性的快速鉴定方法。本专利技术采用的技术方案为1)将PSA上纯培养的病原菌用灭菌水洗下，倍比稀释在光学显微镜下血球计数板计数，计算出分生孢子浓度为104-106CFU/ml；2)选取中等大小的芋头，用清水洗净凉干，将芋头切成2-3cm厚的圆片，放入0.1％的次氯酸钠中浸泡10min，然后用灭菌水冲洗3次，每次3min，取出凉干；3)用移液枪在芋头片中央加新鲜的孢子悬浮液5μL-10μL。每次均以等量灭菌水注入作为对照，重复三次；4)将接种后的芋头片放入白瓷盘中，盘内放入泡水棉花的小培养皿，盘外罩塑料薄膜；5)将罩好的白瓷盘置于22-30℃的恒温箱中，隔天观察，测量病菌的生长直径。本专利技术的有益效果1效率高。本专利技术以病菌在芋头片上的快速生长代替对原寄主的致病性测定，结果快速，不但菌丝生长快，且子囊壳产生的时间也快(2天)。可在短时间内对大量菌株进行致病性鉴定。2操作简单。本专利技术所采用的芋头易于购买，价格便宜，不易腐烂、变色。在病原菌致病性测定的方法中，代替对生长条件要求高，接种到症状显现时间长的石榴苗，方法简单易行。3结果可靠。经对石榴苗接种发现病菌与在芋头片上的生长速度成正相关，效果直观。应用芋头片快速筛选石榴枯萎病菌的致病性，使异地操作简单易行，极大地提高了工作效率。具体实施例方式实施例一接种石榴苗与接种芋头片的发病比较孢子悬浮液的制备将PSA上纯培养的病原菌用灭菌水洗下，倍比稀释，在光学显微镜下数血球计数板小方格里的孢子数，计算出平均每格分生孢子含量，使终浓度为106CFU/ml。石榴苗浸根接种将石榴苗浸入孢子悬浮液中，30min后取出种植于内径为22cm的塑料盆中，由并定期观察，记载发病情况。结果见表(1)。芋头片接种1)将PSA上纯培养的病原菌用灭菌水洗下，倍比稀释在光学显微镜下血球计数板计数，计算出分生孢子浓度为104CFU/ml。2)选取中等大小(100-250g)的芋头，用清水洗净凉干，将芋头切成2-3cm厚的圆片，放入0.1％的次氯酸钠中浸泡10min，然后用灭菌水冲洗3次，每次3min，取出凉干。3)用移液枪在芋头片中央加新鲜的孢子悬浮液5μL。每次试验均以5μL灭菌水注入作为对照，重复三次。4)将接种后的芋头片放入白瓷盘中，盘内放入泡水棉花的小培养皿，盘外罩塑料薄膜。5)将罩好的白瓷盘置于22℃的恒温箱中，隔天观察，测量病菌的生长直径。结果见表(2)。由表(1)和表(2)可看出接种石榴苗发病最快需要5周，19周50％的植株发病，28周75％的植株发病；接种芋头片2天菌丝生长且产生子囊壳。表(1)浸根接种石榴苗发病情况 表(2)接种芋头片病菌生长情况 注(P为子囊壳) 实施例二接种石榴块与接种芋头片的发病比较孢子悬浮液的制备同实施例1。接种组织块将石榴枝条用清水冲洗干净后，用灭菌手术刀除掉树皮，取维管束3×4mm2小块组织，经70％酒精溶液消毒10-30s，再用0.1％的升汞消毒3-6min，用灭菌水漂洗三次，每次3min，用灭过菌的滤纸吸干水移至PA培养基上，取10μL孢子悬浮液滴在组织上，置于28℃的恒温箱中培养，并定期观察。结果见表(3)。芋头片接种1)将PSA上纯培养的病原菌用灭菌水洗下，倍比稀释在光学显微镜下血球计数板计数，计算出分生孢子浓度为106CFU/ml。2)同实施例一芋头片接种2)。3)用移液枪在芋头片中央加新鲜的孢子悬浮液10μL。每次试验均以10μL灭菌水注入作为对照，重复三次。4)同实施例一芋头片接种4)。5)将罩好的白瓷盘置于28℃的恒温箱中，隔天观察，测量病菌的生长直径。由表(3)可看出接种石榴块菌丝第4天开始生长，子囊壳则在第8天以后，虽然大致可看出菌丝的长势，但由于石榴块太小，因不能剪掉石榴的大枝条，且枝条也只有在石榴树整枝打杈时易获得。同时也由于菌丝生长慢，无法准确测量菌丝生长直径。而接种芋头片2天菌丝生长且产生子囊壳，菌丝直径1-1.2cm。表(3)接种石榴块病菌生长情况 注(M为菌丝，P为子囊壳，+为少量菌丝，++为菌丝量中等，+++为菌丝量多)实施例三接种石榴块与接种芋头片的发病比较孢子悬浮液的制备同实施例一。接种组织块将石榴枝条用清水冲洗干净后，用灭菌手术刀除掉树皮，取维管束3×4mm2小块组织，经70％酒精溶液消毒10-30s，再用0.1％的升汞消毒3-6min，用灭菌水漂洗三次，每次3min，用灭过菌的滤纸吸干水移至PA培养基上，取8μL孢子悬浮液滴在组织上，置于25℃的恒温箱中培养，并定期观察。结果见表(3)。芋头片接种1)将PSA上纯培养的病原菌用灭菌水洗下，倍比稀释在光学显微镜下血球计数板计数，计算出分生孢子浓度为105CFU/ml。2)同实施例一芋头片接种2)。3)用移液枪在芋头片中央加新鲜的孢子悬浮液8μL。每次试验均以10μL灭菌水注入作为对照，重复三次。4)同实施例一芋头片接种4)。5)将罩好的白瓷盘置于25℃的恒温箱中，隔天观察，测量病菌的生长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物病原真菌致病性的快速鉴定方法，其步骤是：１）将ＰＳＡ上纯培养的病原菌用灭菌水洗下，倍比稀释在光学显微镜下血球计数板计数，计算出分生孢子浓度为１０↑［４］－１０↑［６］ＣＦＵ／ｍｌ；２）选取中等大小的芋头，用清水洗净凉 干，将芋头切成２－３ｃｍ厚的圆片，放入０．１％的次氯酸钠中浸泡１０ｍｉｎ，然后用灭菌水冲洗３次，每次３ｍｉｎ，取出凉干；３）用移液枪在芋头片中央加新鲜的孢子悬浮液５μＬ－１０μＬ，每次均以等量灭菌水注入作为对照，重复三次；４ ）将接种后的芋头片放入白瓷盘中，盘内放入泡水棉花的小培养皿，盘外罩塑料薄膜；５）将罩好的白瓷盘置于２２－３０℃的恒温箱中，隔天观察，测量病菌的生长直径。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄琼，陈海如，王云月，焦玉霞，邵思胜，杜静，尹明权，赵莹莹，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]