本发明专利技术公开了一种筛查唐氏综合征高危胎儿的方法。该方法用实时荧光定量ＰＣＲ同时检测孕妇外周血血浆或血清游离ＤＮＡ中小于５００ｂｐ的ＤＮＡ组份中非２１号染色体上在进化和功能上稳定的基因片段的Ｃｔ值、２１号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因片段的Ｃｔ值，计算出所述两个Ｃｔ值之差的绝对值；和用所述实时荧光定量ＰＣＲ检测至少２０份怀正常胎儿孕妇外周血血浆或血清游离ＤＮＡ中小于５００ｂｐ的ＤＮＡ，计算出所述两个Ｃｔ值之差的绝对值的平均值，进行比较；如待测孕妇的｜△Ｃｔ｜大于怀正常胎儿孕妇的｜△Ｃｔ｜的平均值与２ＳＤ之和，则该待测孕妇怀的胎儿为高风险唐氏综合征胎儿。该筛查唐氏综合征高危胎儿的方法无创，准确度和灵敏度高；假阳性率假阴性率低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
唐氏综合征(D.S，又称21-三体综合征，先天愚型)是引起严重智力低下的最常见的先天性染色体数目异常性疾病，发生率约1/800；35岁以上高龄孕妇发生率更高。D.S.患者的21号染色体为2条，较正常人多出1条，即其“原始拷贝数”是正常人的1.5倍。对此病至今无有效治疗方法，给家庭和社会造成极大负担。产前筛查和基因诊断是避免此类病儿出生的有效手段。我国卫生部制定的《产前诊断技术管理办法》和北京市卫生局制定的《产前诊断技术管理办法》实施细则均规定了必须对唐氏综合征等进行产前筛查及相应的技术规范。现行唐氏综合征高危胎儿筛查(唐筛)临床应用较广的是用酶联免疫法测孕妇孕中期外周血血清中α-FP(甲胎蛋白)和hCG(人绒毛膜促性腺激素)、uE3(游离雌三醇，unconjugatedEstriol)，用计算机软件综合分析上述两-三项测定结果及孕妇年龄、体重及准确的孕周等，计算出胎儿患上D.S及神经管畸形(NTD)的风险率。筛出的“高危孕妇”，被建议进一步抽取羊水，作核型分析，以便准确查出D.S及可能的18三体，或13-三体等异常。此种方法能同时计算出NTD的风险。但据近几年国内大量筛查的结果看，普遍反映其假阳性率很高，(筛几千例竟未查出1例阳性)；并且还有一定的漏检率，即筛查为低风险的孕妇中产下了D.S患儿(孙念姑，唐氏筛查，中国的现状与对策，第五届全国产前诊断学术研讨会论文汇编，2005年9月，湖北武汉P38；刘子建，产前诊断，香港的经验和教训，第五届全国产前诊断学术研讨会论文汇编，2005年9月，湖北武汉P37)。另一种是用B超观察测量胎儿颈项透明层的厚度(NT)的异常作为D.S胎儿的辅助诊断指标。但这种指标对操作者的经验、技巧及仪器等要求均很高，灵敏度低，仅60-70％，受孕妇体重、糖尿病和吸烟等影响，误差也很大；正在进一步研究和总结经验之中(严英榴，遗传超声，第五届全国产前诊断学术研讨会论文汇编，2005年9月，湖北武汉P51)。吕时铭等用多重实时定量PCR技术对目标基因和内参分子标记进行同管扩增，通过二者ΔCT值来确定21号染色体数目并由此诊断21-三体综合征(吕时铭等，申请号CN200510049601.2，实时定量PCR技术检测人21号染色体数目的方法)。此技术较建立在标准曲线基础上的绝对定量方法(郑明明，胡娅莉等，实时荧光定量PCR技术在产前诊断唐氏综合征中的应用.中华妇产科杂志，2004，39678-681)更简便、更准确；但不能用于无创产前筛查。此外，刘敬忠还首创了运用SYBR Green 1实时荧光PCR结合融解曲线分析法对D.S作出诊断的技术(刘敬忠，申请号CN200510055338.8，唐氏综合征基因诊断新技术及其应用)。上述三种技术检测的都是羊水细胞，绒毛或白细胞DNA，都是用于对D.S的诊断或有创性产前诊断，而不是无创产前筛查。近年来发现孕妇外周血血浆和血清中有游离DNA，且包含胎儿DNA，虽然后者占的比例很低(Lo YM，Corbetta N，Chamberlain PF et al，Presence of fetalDNA in maternal plasma and serum.Lancet 1997，350485-487)。进而Li Y等报道用凝胶电泳法将孕妇血浆总DNA分成不同长度的组份，发现在≤300bp的组份中，胎儿DNA占的比例最高，(占28.4％～68.7％)(Li Y，Zimmermann B，Rusterholz C et al，Size Seperation of circulatory DNA in maternal plasmapermits ready detection of fetal DNA polymorphisms.Clin.Chem，501002-1011，2004)。这样对原本浓度很低的胎儿DNA就起了一个富集的作用。从这一组份的DNA通过多重PCR扩增21号染色体上多个STR位点片段，然后经ABI310自动分析，从峰型中能很明确地诊断出男性胎儿，从而能进行性连锁单基因遗传病、RhD母婴血型不配的无创产前诊断；同时能查出胎儿是否继承了父亲的β-珠蛋白基因的突变或21号染色体上父源特异的多态性标志(STR)。但由于不能辨别胎儿从母亲继承的STR峰究竟是一条还是二条(被孕妇DNA峰掩盖)，由此他们认为尚不能从孕妇外周血游离DNA检测出胎儿是否患有21-三体综合征(Li Y，Zimmermann B，Rusterholz C et al，Size Seperation of circulatoryDNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms.Clin.Chem，501002-1011，2004)。从孕妇外周血分离获取胎儿有核红细胞继而用基于PCR的技术诊断D.S。胎儿虽然是无创性的技术(Samura O，Sohda S，JohnsonK，et al，Diagnosis of trisomy 21 in fetal nucleated erythrocytes frommaternal blood by use of short tandem repeat sequences.Clin.Chem.2001，471622-1626)，但由于获得的胎儿有核红细胞数目太少，需要昂贵的仪器设备，单细胞PCR的高难度等，故仍处于个别实验室的研究阶段。实时荧光定量PCR(real-time Q-PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板分子最初的拷贝数。首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个阈值(域值)(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，域值的设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个PCR反应的Ct值与该PCR模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要测得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。最常用的Real-time Q-PCR是Taqman探针技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术所提供的筛查唐氏综合征高危胎儿的方法，是用实时本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种筛查唐氏综合征高危胎儿的方法，是用实时荧光定量ＰＣＲ同时检测孕妇外周血血浆或血清游离ＤＮＡ中小于５００ｂｐ的ＤＮＡ组份中非２１号染色体上在进化和功能上稳定的基因片段的Ｃｔ值、２１号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因片段的Ｃｔ值，计算出所述两个Ｃｔ值之差的绝对值，得到待测孕妇的｜△Ｃｔ｜；和用所述实时荧光定量ＰＣＲ检测至少２０份怀正常胎儿孕妇外周血血浆或血清游离ＤＮＡ中小于５００ｂｐ的ＤＮＡ组份中非２１号染色体上在进化和功能上稳定的基因片段的Ｃｔ值、２１号染色体上与唐氏综合征的发生相关的基因片段的Ｃｔ值，计算出所述两个Ｃｔ值之差的绝对值的平均值，得到怀正常胎儿孕妇的｜△Ｃｔ｜的平均值；如待测孕妇的｜△Ｃｔ｜大于怀正常胎儿孕妇的｜△Ｃｔ｜的平均值与２ＳＤ之和，则该待测孕妇怀的胎儿为高风险唐氏综合征胎儿；所述２ＳＤ为怀正常胎儿的孕妇的｜△Ｃｔ｜的二倍标准差。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘敬忠，肖白，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京朝阳医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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